中草药复方对断奶仔兔免疫性能及抗氧化性能的影响

韩 昱， 刘 月， 张 宁， 周国玺， 冯海伟， 张立永， 张富梅

（1.河北北方学院，河北张家口 075000；2.河北省畜牧兽医研究所，河北保定 071000；3.河北省张家口市农业综合行政执法支队，河北张家口 075000；4.北京金星鸭业有限公司，北京 100076）

我国作为养殖兔和出口兔最多的国家， 兔产业极大地带动了我国各项产业的经济发展。 断奶仔兔作为兔生长的基础阶段， 在兔整个发育过程中起着至关重要的作用。 但是断奶仔兔由于免疫机能不完善，难以抵抗外界的侵害，是饲养管理过程中比较棘手的一个问题。 由此导致的腹泻是影响断奶仔兔生产养殖的主要原因。据统计，在一个平均为20%死亡率的兔群中，70%以上系腹泻病所致（赵泮峰，2011；桑英智，2011）。抗生素由于耐药性、药物残留等诸多弊病，作为预防兔腹泻的药物已成为过去，随着无抗养殖时代的到来，寻求抗生素替代品，采用绿色有效的方法预防兔腹泻，并且研究其作用机制成为一种趋势（徐文龙，2009）。本研究通过在断奶仔兔日粮中添加中草药复方，研究其对仔兔免疫性能和抗氧化性能的影响，从而为减少断奶仔兔腹泻，促进生长，保障养兔业健康绿色发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 基础日粮由张家口某养兔场提供。中草药购自河北北方学院校医院，主要成分为白头翁、茵陈、黄连、党参、黄芪等，粉碎后过60 目筛，按比例均匀混合于饲料中并加工成颗粒料。

1.2 试验设计 本试验选取体重相近、健康的30日龄伊拉兔断奶幼兔60 只，公母各半，随机分为2 组，每组3 个重复，每个重复10 只。 A 组为对照组，饲喂基础日粮，B 组为试验组，饲喂基础日粮+1%中草药复方。 各组仔兔断奶后自由采食5 d 进入试验期，试验期60 d。 试验期间饲喂量、饲喂次数及时间相同， 在同一饲养环境及管理方法下进行饲养。

1.3 试验测定项目和方法 于试验第30 天和60天分别从对照组及试验组中每个重复中随机选择4 只兔，公母各半，每组共12 只，无菌耳缘静脉采血5 mL，静置3 h，3000 r/min 离心10 min，制备血清， 并将血清分装到1.5 mL 离心管中，-20 ℃冷冻保存。将兔剖解，取脾脏、胸腺和肝脏，进行相关指标测定。

1.3.1 免疫指标测定方法

1.3.1.1 免疫器官指数测定 摘出新鲜的脾脏和胸腺，去掉其表面的脂肪组织并进行称重，计算其指数。

免疫器官指数/（g/kg）＝器官鲜重/活体重量。

1.3.1.2 血清IgG 含量及血清细胞因子 （IL-2、IL-6） 含量测定 血清样品送北京华英生物技术研究所。 血清IL-2、IL-6 含量采用酶联免疫法测定，血清IgG 含量采用比色法进行测定（A6 半自动生化仪）。

1.3.1.3 脾 脏IL-2、IFN-γ mRNA 表 达 量 测 定取脾脏样品相同位置， 用4 ℃生理盐水进行冲洗后， 用锡箔纸包裹， 先放入液氮中速冻， 然后移入-80 ℃冰箱中待用。 样品按试剂盒（Invitrogen）操作说明进行总RNA 提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量， 并经紫外分光光度计测得A260/A280值在1.8 ～2.0，验证所提RNA 质量合格。取1.0 ～5.0 μg 总RNA，按反转录试剂盒（Roche）操作说明反转录合成cDNA， 并以此为模板利用荧光定量PCR 技术测定IL-2 基因表达量。 PCR反应体系20 μL，其中包括5 μL cDNA 模板，上、下游引物各0.4 μL。

IL-2 上、 下游引物序列分别为：CTACTGCTGGATTTACAGGTGCT和TCTGTGACCTTCTTGGGCATAT；IFN-γ 上、 下游引物序列分别 为：TTCTTCAGCCTCACTCTCTCC 和TGTTGTCACTCTCCTCTTTCC；内参GAPDH 上、下游引物序列分别为：CGCCTGGAGAAAGCTGCTA 和ACGACCTGGTCCTCGGTGTA；PCR 反应条件为：预变性95 ℃10 min；然后95 ℃15 s，60 ℃60 s，75 ～95 ℃，每20 s 升温1 ℃，40 个循环。

1.3.2 血清抗氧化指标测定 测定血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。 以上均采用721 型分光光度计进行测定，操作按试剂盒说明书进行。

1.4 数据处理及分析 试验数据使用统计软件SPSS 19.0 进行分析， 结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 中草药复方对仔兔免疫性能的影响

2.1.1 中草药复方对仔兔免疫器官指数的影响表1 显示，与对照组相比，试验30 d 仔兔脾脏指数显著提高17.78%（P＜0.05），而试验60 d 脾脏指数在一定程度得到提高（P＞0.05）。 另外，试验30 d 和60 d 胸腺指数均有一定提高，但差异均不显著（P＞0.05）。 由此说明，中草药复方能够有效提高仔兔的免疫器官指数。

表1 中草药复方对仔兔免疫器官指数的影响g/kg

2.1.2 中草药复方对仔兔血清免疫指标的影响表2 显示，试验30 d 试验组仔兔血清中IgG 含量较对照组增多，但差异不显著（P＞0.05），IL-2 和IL-6 含量分别显著升高20.91%和9.33%（P＜0.05）； 试 验60 d 仔 兔 血 清 中IgG 含 量 升 高10.36%（P＜0.05），IL-2 和IL-6 含量分别极显著升高61.71%和22.88%（P＜0.01）。 由此说明，饲料中添加中草药复方能够有效提高伊拉兔仔兔血液中的免疫指标水平。

表2 中草药复方对仔兔血清免疫指标的影响

2.1.3 中草药复方对仔兔脾脏IL-2、IFN-γ mRNA 表达量的影响 图1 和图2 显示， 与对照组相比， 试验组在试验30 d 和60 d 的IL-2 mRNA表达量均得到显著提高（P＜0.05），IFN-γ mRNA表达量在一定程度上提高， 但差异不显著 （P＞0.05）。 由此在分子机制层面说明，中草药复方能够有效改善伊拉兔仔兔免疫性能。

图1 中草药复方对仔兔脾脏IL-2 mRNA 表达量的影响

图2 中草药复方对仔兔脾脏IFN-γ mRNA 表达量的影响

2.2 中草药复方对仔兔血清抗氧化性能的影响由表3 可见，断奶仔兔日粮中添加中草药复方，总体趋势可以增加血清中GSH-Px 和SOD 活性，降低MDA 含量， 即可以显著改善仔兔机体的抗氧化性能。其中试验组30 d GSH-Px 和SOD 水平以及60 d SOD 水平较对照组分别显著提高3.37%、14.05%和13.57%（P＜0.05），60 d MDA 含量较对照组极显著降低17.24%（P＜0.01）。

表3 中草药复方对仔兔血清抗氧化指标的影响

3 讨论

3.1 中草药复方对断奶仔兔免疫性能的影响仔兔腹泻多发生在断奶至断奶后2 个月这个阶段， 该阶段仔兔的免疫性能直接影响其对腹泻致病菌的抵抗力。免疫器官指数、血清中IgG 以及细胞因子IL-2 和IL-6 含量的变化可以反映机体免疫性能的高低。 在一定范围内免疫器官指数越高其免疫功能越强（张永翠，2008）。 IgG 是血清中主要的免疫球蛋白，具有抗细菌、抗病毒、抗外毒素等多种活性（马春全，2004）。 IL-2 和IL-6 是机体重要的细胞因子。 IL-2 主要由T 细胞产生，最显著的作用是影响T 淋巴细胞的生长，也能够促进B 细胞的生长及分化。 IL-6 主要由单核巨噬细胞、Th2 细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生。能够刺激活化B 细胞增殖，分泌抗体，刺激T 细胞增 殖（Ahrens，2021；Holmer，2014；Smolen，2006）。IFN-γ 是由机体内活化的T 淋巴细胞和NK 细胞产生的一种糖蛋白，IFN-γ 除具有抗病毒、抗胞内寄生菌和寄生原虫的作用外， 还具有独特而强大的免疫调节功能（龙振洲，1998）。

李学钊等（2016）研究发现，中草药饲料添加剂能够有效增加獭兔免疫器官指数， 尤其是显著增加胸腺质量和指数；左晓磊等（2015）研究发现，中草药制剂能够提高獭兔胸腺指数、脾脏指数；崔艳丽等（2008）通过小鼠腹腔注射0.25%或0.1%黄芪多糖， 发现其能增加小鼠脾细胞数及脾脏重量。有研究表明，添加中草药制剂可提高獭兔血清中IgG、IgA 含量， 其中添加1.5%中草药制剂组IgG 含量差异显著 （郭剑英等，2012）； 郝福星等（2008）发现，复方中草药制剂可明显提高仔猪血清中IL-2 含量；高文婧等（2019）发现，复合中草药添加剂能够提高芦花雏鸡脾脏IL-2m RNA 的表达量。李云鑫（2020）发现，六位中草药能够有效提高细胞因子IL-2 和IFN-γ 的mRNA 表达水平，从而提高肉鸡免疫性能。

本研究针对断奶仔兔腹泻率和死亡率高的现状，按照中医辩证理论筛选了具有清热解毒、凉血止痢、滋补气血、健脾和胃、消食化积效果的中草药复方， 课题组前期试验证明其能够显著降低断奶仔兔腹泻率和死亡率（韩福生等，2018）。本试验研究结果发现， 所用中草药复方可以明显提高仔兔脾脏指数和胸腺指数， 可以显著提高血清中IgG 含量和IL-2 和IL-6 水平。 为了从分子机制上进行探讨， 对脾脏中IL-2 和IFN-γ mMRA 表达量进行了测定分析， 发现试验组两种基因表达量均升高，其中IL-2 mMRA 表达量变化显著。 研究表明， 该中草药复方显示了能提高断奶仔兔的免疫性能的作用， 这从一个很重要的方面证实了该中草药复方在预防仔兔腹泻应用上的可行性。中草药复方中党参和黄芪的使用， 通过对仔兔气血的滋补，可以提高机体的抗病力和免疫力，从而显著降低断奶仔兔腹泻率和死亡率。

3.2 中草药复方对断奶兔仔兔抗氧化性能的影响 GSH-Px、SOD 的活性可以充分反映动物机体的抗氧化能力， 其主要作用是可以帮助动物机体抵挡自由基的伤害。当自由基攻击动物机体时，机体就会产生MDA， 因此当动物机体MDA 含量升高时，就表明机体正在遭受自由基的伤害（申瑞玲等，2000）。有数据显示，把中草药复方添加在断奶仔猪的日粮中进行饲喂， 可以增强其自身的抗氧化能力， 是因中草药可以明显提升血清中超氧化物酶的活性，降低自由基对机体的损伤程度，同时也不会产生更多的MDA（尹富贵等，2007）。 本试验结果表明， 中草药复方能够有效增强仔兔血清中GSH-Px 和SOD 活性， 尤其显著增强SOD 活性，另外对MDA 含量也有较好的降低作用。 说明该中草药复方可以有效改善仔兔体内的抗氧化性能。 这从另一方面阐述了中草药复方在预防仔兔腹泻、提高生产性能方面的可行性。

4 结论

本试验结果表明， 所用中草药复方能够明显增强断奶仔兔的免疫力，提高其抗氧化性能，并且对增强其机体抵抗力， 减少腹泻的发生具有积极作用。