不同来源虎杖指纹图谱研究

曾 梅，孙 晶，范 蓓，刘 聪,3，李 灿，刘湘丹,4,5，王凤忠*,周日宝,4,5*

（1.湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙 410208；2.中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工重点实验室，北京 100193；3.长沙卫生职业学院 药学院，湖南 长沙 410208；4.湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室，湖南 长沙 410208；5.湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室，湖南 长沙 410208）

中药材虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根及根茎，属多年生草本[1]，我国大部分地区均有分布，主产于江苏、江西、四川、湖南等地[2]。虎杖性寒、味苦，归肝、肺、胆经，主要含有蒽醌类、黄酮类、二苯乙烯类等化合物[3-5]，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效。临床用于治疗风湿痹痛、痰多咳嗽、跌打损伤等症[6]。经研究发现，虎杖药材质量的相关研究大多数仅以不同产地作为研究点，同时进行不同采收时间、生长年限、土壤类型、产地环境虎杖药材质量的研究未见报道。笔者广泛收集了不同采收时间、不同生长年限、不同土壤类型、不同产地环境等多种类型的虎杖药材样品，利用高效液相色谱法建立虎杖指纹图谱，以期为中药材虎杖的质量控制及进一步开发利用虎杖资源提供实验依据[7]。

1 材料

1.1 仪器

SK8200 型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限 公 司）；Agilent Technologies 1260 Inginity 型 高 效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；BCD-452 WDPF 型冰箱（青岛海尔服务有限公司）；Eco-S15型实验室纯水系统（上海和泰仪器有限公司）；ME204E/02 型电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）公司］；YF-500 型高速中草药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 试剂与药材

甲醇（分析纯，安徽天地高纯溶剂有限公司）；磷酸（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；乙腈（色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司）；虎杖苷对照品（纯度≥98%，批号：B20533），白藜芦醇对照品（纯度≥98%，批号：B20044），蒽苷B 对照品（纯度≥98%，批号：B20241），大黄素对照品（纯度≥98%，批号：B20241），大黄素甲醚对照品（纯度≥98%，批号：B20242）均购于上海源叶有限公司。

课题组于2018 年和2019 年分别从不同产地收集了18 批虎杖药材样品，样品由湖南中医药大学中药资源教研室周日宝教授鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根和根茎，具体信息见表1。

表1 虎杖样品信息表Tab.1 Sample information table of Polygonum cuspidatum

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）和0.1%磷酸水溶液（B），按照以下色谱条件洗脱：0 ～ 10 min，80%→73%；10 ～ 18 min，73%→65%；18 ～ 24 min，65%→55%；24 ～ 34 min，55%→5%；34 ～ 40 min，5%→80%；流速：1.0 mL/min；色谱柱温度：25℃；进样量：10 μL；检测波长：287 nm。

2.2 对照品溶液制备

精密称取虎杖苷0.026 0 g、白藜芦醇0.003 8 g、大黄素0.005 0 g、大黄素甲醚0.022 0 g、蒽苷B 0.003 2 g、置于10 mL 容量瓶中，再精密加入80%甲醇溶解，定容，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，密封保存于4 ℃避光处，备用。

2.3 供试品溶液制备

精密称取虎杖样品细粉（过6 号筛）0.500 0 g，置于100 mL 锥形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇，进行称重，超声（20 KHz、25℃）30 min后取出再称重，如重量减失，用80%甲醇补足失重，摇匀，经过滤后取适量续滤液，再用0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取S18 号样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样6 次，以虎杖苷作为参照峰，各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.64 %，相对峰面积RSD 均小于1.20%，说明仪器有较好的精密度。

2.4.2 重复性试验 取S18 号样品6 份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样。以虎杖苷为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.38%，相对峰面积RSD 均小于1.80%，表明该方法有良好的重复性。

2.4.3 稳定性试验 取S18 号样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下分别于0、2、6、8、10、12 h 进样，以虎杖苷为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.38%，相对峰面积RSD 均小于2.00%，表明供试品溶液在12 h 内有良好的稳定性。

2.5 指纹图谱建立

2.5.1 不同来源虎杖图谱 按照“2.3”项下方法，取表1 中的各批虎杖样品制备成供试品溶液，并且按照“2.1”项色谱条件进行进样。接着采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”对各样品的HPLC 色谱图进行数据匹配，生成对照图谱R，并计算相似度。软件计算得出，18 批不同来源虎杖样品，共检测到55 个色谱峰，确定了其中10 个峰为共有峰，占总峰面积的85.41%，18批虎杖指纹图谱见图1。

图1 不同来源虎杖HPLC 指纹谱图Fig.1 HPLC fingerprint spectra of Polygonum cuspidatum from different sources

2.5.2 参照峰选择 与对照品保留时间比对后，指认了五种成分，分别为2 号峰（虎杖苷）、5 号峰（白藜芦醇）、6 号峰（蒽苷B）、8 号峰（大黄素）、10 号峰（大黄素甲醚）。其中，虎杖苷为二苯乙烯类化合物，文献研究发现其具有扩张血管、溶血栓、抑制血小板凝集和改善血液循环、抗菌、抗休克等作用[8-11]，且在各批虎杖样品中分离良好，峰形稳定，峰面积较大且为所有样品共有，故确定虎杖苷为参照峰（S），虎杖对照图谱见图2。

2.5.3 相似度评价 将18 批虎杖药材指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”软件，按照“2.5.1”项下方法分析，计算样品与对照图谱R 的相似度，结果见表2。结果表明，18 批虎杖样品相似度为0.941 ～ 0.999，表明18 批虎杖样品化学成分相似性较高。计算各批虎杖样品的共有峰峰面积及相对保留时间的RSD，结果见表3，由结果可以得出各批样品质量具有较大差异。

表2 不同来源虎杖相似度计算结果Tab.2 Similarity calculation results of Polygonum cuspidatum from different sources

表3 不同来源虎杖共有峰平均相对保留时间及峰面积Tab.3 Average relative retention time and peak area of Polygonum cuspidatum from different sources

2.5.4 聚类分析 以各共有峰的峰面积为变量，以欧氏距离为测度，采用IBM SPSS Statistics 软件以组间联接法对不同来源虎杖进行聚类分析，结果见图3。由图3 可知，从阈值5 处，18 批不同虎杖样品可聚为6 类：S18 为一类；S15、S12、S14、S16 为一类；S13 为一类；S4、S11、S9 为一类；S1、S2、S3 为一类；S5、S8、S6、S7、S17、S10 为一类。

图3 不同来源虎杖聚类分析树状图Fig.3 Cluster analysis tree of Polygonum cuspidatum from different sources

2.5.5 主成分分析 主成分分析（PCA）是指为了达到简化分析的目的，在尽量保持原有信息的条件下，将个数比较多且存在相关性的指标转换成个数较少且彼此独立或不相关的综合性指标[12]。本实验将18 批不同来源虎杖样品的10 个共有峰峰面积导入IBM SPSS Statistics 软件，对共有峰峰面积进行主成分分析，特征值及贡献率结果见表4，旋转变化后的成分矩阵见表5，应用IBM SPSS 软件进行主成分分析后数据窗口最后列出3 个主成分的因子得分值再计算综合得分，根据综合得分情况对18 批虎杖药材进行排序，结果见表6，排名越靠前说明虎杖质量越好。

表4 虎杖PCA 的特征值与贡献率结果Tab.4 Characteristic values and contribution rate of PCA of Polygonum cuspidatum

表5 虎杖PCA 成分矩阵Tab.5 PCA component matrix of Polygonum cuspidatum

表6 18 批虎杖主成分得分及排名Tab.6 Principal component scores and ranking of 18 batches of Polygonum cuspidatum

由表4 可知前面三个主成分的特征值均大于1，且累计贡献率为78.971%，表明前三个主成分可以代表所有成分进行分析，从表5 可以看出，第一主成分主要来自1、2、3、4、6、8、10 号峰，第二主成分主要来自于5、9 号峰，第三主成分主要来自于7 号峰。经查阅数据及与对照品对照，第一主成分为虎杖苷、蒽苷B、大黄素、大黄素甲醚，第二主成分为白藜芦醇。表明虎杖苷、白藜芦醇在特征变量的重要性评估中具有优势，主成分分析综合排序结果与聚类分析结果相类似，进一步证实该分析方法可用于药材质量的评价。

3 讨论

预实验进行了不同比例（50%、80%、100%）甲醇、不同提取时间（15、30、45、60 min）、不同提取方法（超声、回流、浸渍）的供试品制备对比研究，研究发现，80%甲醇超声提取30 min，供试品色谱峰面积较大、分离度较好，且实验成本相对较低，故本研究采用80%甲醇为提取溶剂、超声提取30 min进行供试品提取。

采用了UV 检测器对虎杖供试品溶液进行200 ～400 nm 全波长扫描，发现虎杖苷和白藜芦醇在310 nm左右有最大吸收，大黄素、大黄素甲醚、蒽苷B 在287 nm 处有最大吸收，且指纹图谱色谱峰较多，峰形及分离度较好，综合考虑确定最佳扫描波长为287 nm。

在HPLC指纹图谱中，不同来源虎杖相似度0.941 ～0.999，表明不同来源的虎杖化学成分无显著差异；结合各共有峰峰面积RSD 结果及聚类分析、主成分分析结果得出不同来源虎杖质量有明显差异；结合聚类分析结果，主成分综合得分情况排名前三的样品被聚为一类，包括在8 月至9 月之间采收的三批耕地种植的三年生虎杖，进一步说明了这三批药材的质量最佳。提示在虎杖栽培中，为提高产量可选择耕地栽种三年，虎杖采挖时间应选择8 月至9 月这一时间段。

4 结论

本研究建立了不同来源虎杖药材HPLC 指纹图谱分析方法，结合相似度计算、聚类分析、主成分分析三种分析方法进行不同来源虎杖中药材质量评价分析，所建HPLC 指纹图谱可用于综合评价不同来源虎杖质量，可为虎杖药材的质量控制提供参考。