黄瓜果实内源激素与果实空腔的关系

2022-03-18范晨伟田丽波马丽荣

南方农业学报 2022年11期

范晨伟，田丽波*，商桑，马丽荣，杨怡

（1海南大学园艺学院/海南省热带园艺作物品质调控重点实验室，海南海口 570228；2海南大学生命科学学院，海南海口 570228）

0 引言

【研究意义】黄瓜（Cucumis sativusL.）是葫芦科黄瓜属一年生草本植物，在世界各地广泛种植，同时也是一种十分重要的设施栽培蔬菜（牛志红等，2020）。受基因及环境的影响，黄瓜的生长过程中会出现空腔状况。空腔大小是鲜食和加工黄瓜品质的一个重要指标，影响黄瓜产量及品质，从而导致黄瓜商品性降低。果实的生长主要是指果实细胞的分裂和细胞体积的增大，其中植物内源激素在不同程度上影响着细胞数量及大小，进一步影响着果实的发育（杨晓婉，2013）。因此，测定并分析黄瓜果实内源激素含量与果实空腔的关系，对揭示其内源激素在空腔性状中的功能和作用机制，以及黄瓜优质品种的选育具有重要意义。【前人研究进展】近年来，已有学者相继对植物果实空腔性状形成原因展开研究。研究表明，果实空腔形成主要由遗传决定，但也受环境方面影响。温度（陈刚明和周建业，2008）、肥水管理（孙如轩和夏海生，2010）、气候（周光军和陵军成，2012）、品种（苍涛等，2017）及营养不均衡（胡南等，2021）等因素均可导致果实出现空腔性状。在黄瓜空腔形成的遗传基础方面，Wang等（2020）在2个群体中重复定位到1个位于黄瓜2号染色体上的QTL，候选区间大小为17.50 Mb（Gy14 V2.0），推断其很可能是决定黄瓜空腔性状的QTL。在果实成熟过程中，植物激素参与细胞的增殖，共同促进果实生长；周赓等（2021）利用2个四世代杂交组合，通过主基因和多基因混合模型发现黄瓜果实空心性状主要受2对加性—显性主基因和加性—显性多基因控制，同时受到环境的影响。生长素（IBA）的主要作用是促进细胞伸长和体积扩大（利奥波德和克里德曼，1984），赤霉素（GA）可促进细胞膨大（孟庆伟和高辉远，2011），同时参与果实果形的调控（赵晓晓，2019）。Liu等（2016）在研究黄瓜GA受体基因CsGID1a的基础上，分析了黄瓜CsGID1a-RNAi植株的全基因组表达，结果表明黄瓜心室的形成与CsGID1a的表达谱紧密联系，将黄瓜CsGID1a敲除，黄瓜果实心皮和心室会发育畸形，出现严重的黄瓜果实空洞，说明黄瓜果实空腔可能受到GA的调控。在可进行细胞分裂的部位大多会存在细胞分裂素（ZT），如幼嫩的果实、发育中的种子、植物根尖等（王忠，2010）。脱落酸（ABA）是一种植物生长抑制型激素（卢文静，2018），对其他生长促进型激素产生拮抗作用（袁娟等，2004）。【本研究切入点】黄瓜果实空腔性状的调控机制复杂，受遗传及环境等多重因素影响，对其调控机制的研究一直未见深入进展。【拟解决的关键问题】以亲本9930和WI7120为试验材料，通过对果实形态、果实内源激素动态变化和组织结构特征进行观察和测定，明确黄瓜果实内源激素与果实空腔形成的关系，以期为黄瓜优质品种的选育提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材分别为华北型鲜食黄瓜9930和北美加工型黄瓜WI7120品系，种子均由美国威斯康星大学麦迪逊分校黄瓜研究实验室惠赠。试验于2021年8—11月在海南大学农科基地塑料温室内进行，8月将2个黄瓜品系的种子各30粒温汤浸种消毒，然后置于装有双层湿润滤纸的培养皿中，于30 ℃培养箱中培养催芽。待种子露白后一穴一粒播种于穴盘，育苗基质由泥炭土、珍珠岩、有机肥按6∶3∶1混合而成。当黄瓜长至四叶一心后挑选长势良好、整齐的秧苗定植于温室，常规管理，加强对温湿度的控制以及病虫害防治。

1.2 果实性状观察

为观察果实果长、果径及空腔大小的变化，对9930和WI7120植株果实整个生长周期的果长和果径进行动态测量。由于授粉前后，果长和果径变化较快，因此在每品系随机取3个长势均匀的果实，于开花前3 d至授粉后30 d每隔3 d用游标卡尺测果长，在其最粗处测果径。本研究综合果实中部和各心室的空腔大小及形状对果实的空腔情况进行定级，按照成熟黄瓜空腔度0～5级分级标准：果实不空腔为0级，果实中部刚出现空腔为1级，空腔略微增大为2级，心室间分离为3级，心室间分离程度加大为4级，空腔程度达最大为5级（图1）。

图1 成熟黄瓜果实空腔大小分级标准Fig.1 Standard of cucumber mature fruit hollow size

1.3 内源激素含量的测定

利用高效液相色谱法同时测定黄瓜果肉中4种植物激素含量，色谱条件及GA、IBA、ZT和ABA标准溶液的制备参照孟宪明等（2021）实验方法并加以改进。将柱温提升至35 ℃，更接近海南省当前季节的室温，同时加快样品分离速度，将出峰时间提前；将供试品浸渍时间设为16 h，能提高激素提取效率，供试样品采用浸渍提取法。随机挑选授粉后7 d（无空腔出现时期）、15 d（WI7120果实空腔出现的关键时期）和30 d（空腔等级最大时期）的黄瓜果实各3个，用无菌手术刀切割称取果皮、果肉和心皮等部位组织各1 g，每个部位取3个重复，其中心皮的取样仅取折叠的心皮边缘生长在一起的组织（图2），且每个生物学重复为随机挑选的3个果实的混样，以规避内部种子数量对激素含量的影响。用液氮速冻磨碎，精确称取磨碎后的粉末200 mg于2 mL离心管中，加入1 mL 80%甲醇溶液于4 ℃冰箱静置16 h，取800 μL上清液离心，离心后过0.45 μm有机滤膜待用。

图2 黄瓜取样部位Fig.2 Sampling position of cucumber sample

在给定色谱条件下，4种激素均实现基线分离，分离度高且峰形较好，ZT、GA、ABA和IBA的保留时间分别为2.16、2.59、7.48和9.40 min。根据4种激素各自浓度及其对应的峰面积得到线性回归方程，相关系数（R2）均大于0.990（表1），满足定量分析的要求。因而可用各激素对应色谱峰的保留时间进行定性分析。

表1 激素在色谱条件下的标准曲线Table 1 Calibration curves of the standards of hormones under HPLC conditions

1.4 石蜡切片和显微结构观察

于2个品系各发育时期（授粉后0、7、15和30 d）分别选取长势均匀的果实各3个，用锋利的灭菌刀片分别对果实的果皮、果肉和心皮进行取样。采用常规石蜡切片技术处理，沿瓜长方向，在瓜中部最粗处分别取样，切取长宽高为1.00 cm×1.00 cm×1.50 cm的果实切块。用FAA固定液（50%乙醇90%+冰醋酸5%+福尔马林5%）固定。制作石蜡切片后用番红固绿染色，将切片在Pannoramic DESK、P-MIDI、P250扫描仪显微镜头下快速移动进行扫描成像生成一张全视野的数字化切片，使用Pannoramic scanner扫描软件在50 μm比例尺下观察组织解剖结构。参照徐婧等（2020）的方法，随机选择各处理50个完整细胞统计细胞大小，随机选取10个面积固定的视野（相当于单位视野）统计细胞数（细胞密度）。

1.5 统计分析

采用Excel 2019对试验数据进行整理与分析，绘制表格和折线图。采用SAS 9.1进行差异显著性分析，采用Graphpad prism 8.0绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 黄瓜品系9930和WI7120的果实性状分析

2.1.1 果实发育特征由图3可知，9930的果实粗细较均匀，为中长果型，刺瘤紧密，成熟瓜（授粉后30 d 生长状态）长26～30 cm，果腔中心为实心；WI7120的果实为近圆形，表皮无刺瘤，果腔中心为空心，在授粉后15 d时已出现明显空腔性状，为空腔出现的关键时期，伴随其生长发育，空腔等级逐步扩大，直至果实成熟空腔等级达5级。

图3 黄瓜品系9930和WI7120的果实特征发育图（比例尺为1 cm）Fig.3 Fruit characteristics of cucumber strains 9930 and WI7120（the scale was 1 cm）

2.1.2 果长和果径日增量的变化 2个黄瓜品系果实的果长和果径的日增长量如表2所示。9930的果实从授粉后0～9 d，果长的增长幅度明显大于果径，在第9 d时果长增长幅度降低，授粉15 d以后，果径增长快于果长。WI7120的果实在授粉后6 d内果长的增长幅度大于果径，在授粉后6～15 d，果径的增长速度大于果长，授粉后15～18 d出现果长增长速度大于果径，授粉18 d后，果径的增长速度开始快于果长。结果表明，黄瓜果实发育中前期主要是果实长度的增长，果径伴随着果长的增加而增加。由于在果实发育初期，细胞主要延果长方向分裂，细胞分裂对果长的促进作用大于果径；在果径增长速度快于果长时，细胞膨大占优势。9930果实在授粉后15 d内细胞分裂对果实膨大的促进作用大于细胞膨大；WI7120果实在授粉后6～15 d，细胞膨大对其果实膨大的促进作用大于细胞分裂。

2.1.3 果长和果径日增量的变化趋势由表2和图4可知，2个品系的果实在授粉前后3 d增长非常缓慢，开花后6～18 d快速增长，18 d后趋于平缓。9930的果长日增量在授粉后6～9 d达最大值（16.33 mm），在9～12 d下降至9 mm，然后在12～15 d增长至13 mm，之后持续下降；WI7120的果径日增量在授粉后6 d达5.33 mm，在6～9 d降至3.67 mm，然后在9～12 d增至5.67 mm；可见，9930果长和WI7120果径的日增量整体上均呈上升、下降再上升的变化趋势。而9930果径的日增量在授粉后12 d达最大值后持续降低，WI7120果长的日增量在授粉后6 d达最大值后降低，可见9930果径和WI7120果长的日增量均整体呈先上升后下降的趋势。因此，9930果长和WI7120果径的增长呈双S曲线变化，9930果径和WI7120果长的增长呈单S曲线变化。

图4 黄瓜品系9930和WI7120不同发育时期果长和果径变化趋势Fig.4 Trend of changes of fruit length and diameter at different developmental stages of cucumber strains 9930 and WI7120

表2 黄瓜品系9930和WI7120果实的果长和果径日增量Table 2 Daily growth increase of fruit length and diameter of cucumber strains 9930 and WI7120

2.2 黄瓜品系9930和WI7120的果实内源激素差异分析

2.2.1 果实发育期间ABA、GA、IBA、ZT的变化WI7120的果实GA、IBA和ZT含量整体上均高于9930（图5）；2个品系果实各组织部位的ABA含量在授粉后15 d内均缓慢上升趋势，9930果实的果肉和心皮中ABA含量在授粉后15 d后迅速增加。由图3可知，9930果实在授粉后15 d果皮颜色由绿色转变为黄色，表明在果实转色期内ABA含量的增加加速了果实成熟。9930果实各部位的GA含量在授粉后变化趋势一致，均在授粉后15 d达最小值后又快速增加，且果肉GA含量与心皮差异小。WI7120果实果皮和果肉GA含量在授粉后呈上升趋势，心皮GA含量在授粉15 d达最大值后下降，且心皮GA含量远大于果肉，表明GA对心皮的细胞膨大作用大于果肉，推测GA可能与WI7120果实空腔性状的出现有关。随着果实的横、纵径的增大，2个品系果实各组织部位的ZT含量均在授粉后呈上升趋势，表明ZT含量随着果实的发育而增加，推测ZT与果实横、纵径的发育息息相关。9930果实果皮和心皮IBA含量在授粉后呈上升趋势，果肉IBA含量在授粉后15 d达最大值后趋于稳定，且在授粉后30 d与心皮IBA含量差异极小，分别为2.45和2.42 μg/mL。WI7120果实果皮IBA含量在授粉后一直趋于平稳，维持在较低水平，果肉IBA含量在授粉后30 d达最大值，心皮IBA含量在授粉后15 d达最大值后急速降低，且在授粉后15 d，心皮IBA含量是果肉的2.63倍，表明此时IBA对心皮的细胞膨大作用大于果肉。综上，2个品系黄瓜果实中GA含量均远大于其他3种激素含量，且GA＞IBA＞ZT＞ABA，表明GA在黄瓜果实的发育上起主导作用。

图5 黄瓜品系9930和WI7120果实不同发育时期各激素含量变化Fig.5 Changes of hormone contents in fruits of cucumber strains 9930 and WI7120 at different development stages

2.2.2 果实内源激素与ABA含量比值的变化不同发育时期样品中激素的含量与ABA含量的比值即各激素的相对含量更具典型性和稳定性。如图6所示，WI7120果实各部位各时期的GA/ABA和ZT/ABA均大于9930。且WI7120在授粉后15 d其果实心皮GA/ABA明显大于果肉，与授粉后15 d心皮的GA含量远大于果肉一致；而9930在授粉后15 d心皮的GA/ABA与果肉差异小，亦与授粉后15 d心皮与果肉GA含量差异小的结果一致。上述结果表明，授粉后15 d，WI7120果实心皮的GA含量高于果肉是稳定可靠的，进一步表明GA可能与WI7120果实空腔性状的出现有关。9930果实的果肉和心皮IBA/ABA在授粉后15 d均达最大值；WI7120果实果肉的IBA/ABA在授粉后30 d达最大值，而心皮IBA/ABA在授粉后15 d达最大值而后急速降低，且心皮IBA/ABA大于果肉，与心皮的IBA含量大于果肉的结果一致，表明授粉后15 d WI7120果实心皮的IBA含量高于果肉是稳定可靠的，进一步表明IBA对心皮的细胞膨大作用大于果肉。9930果实各部位的GA/ZT均在授粉后15 d达最小值，且果肉的GA/ZT均大于心皮；WI7120果实果皮的GA/ZT呈下降趋势，果肉和心皮的GA/ZT在授粉后15 d达最大值，且果皮的GA/ZT在授粉后15 d内均大于果肉，而在授粉后30 d小于果肉。综上所述，果实的发育是多种植物激素动态平衡的过程，在授粉后15 d，促进植物生长的植物激素GA、IBA和ZT相对含量在整体上均呈降低趋势。

图6 黄瓜品系9930和WI7120果实不同发育时期各激素相对含量变化Fig.6 Relative contents of hormones in fruits of cucumber strains 9930 and WI7120 at different development stages

2.3 黄瓜品系9930和WI7120的果实石蜡切片结果分析

2.3.1 果实各部位细胞的变化为从细胞层面明确黄瓜果实空腔表型差异的原因，分别对9930和WI7120果实授粉后0、7、15和30 d的果皮、果肉及心皮的取样做石蜡切片（图7）。从授粉后0～15 d，9930和WI7120果实的果皮细胞大小分别膨大8.91和14.50倍，果肉细胞分别膨大49.48和24.51倍，心皮细胞分别膨大38.98和118.70倍。9930果实的果肉和心皮细胞形状在授粉后30 d内均为近圆形；WI7120果实在授粉后7 d内，其果肉和心皮细胞为近圆形，而授粉后15 d及以后，其果肉细胞仍为近圆形，而心皮细胞生长变化为长圆形。

图7 黄瓜品系9930和WI7120果实不同发育时期不同部位石蜡切片横切图（比例尺为50 μm）Fig.7 Crosscutting of paraffin sections in different parts in fruits of cucumber strains 9930 and WI7120 at different developmental stages（scale bar was 50 μm）

2.3.2 果实各部位细胞密度及大小的变化如图8所示，在4个生长发育阶段，9930果实果皮的细胞大小显著小于果肉和心皮（P＜0.05，下同），且其细胞密度显著大于果肉，在0 d时与心皮无显著差异（P＞0.05，下同）。心皮细胞大小在授粉后增长迅速，在授粉15 d及以后显著小于果肉，但细胞密度在15 d时与心皮无显著差异，在授粉后30 d显著高于心皮。WI7120果实果皮的细胞大小在授粉后0 d显著小于果肉且与心皮无显著差异，在授粉后7～30 d均显著小于果肉和心皮，同时其细胞密度均显著大于果肉和心皮。

图8 黄瓜品系9930和WI7120果实不同发育时期的细胞大小和密度Fig.8 Cell size and cell density in fruits of cucumber strains 9930 and WI7120 at different developmental stages

2.3.3 果实细胞密度及大小与激素变化的关系授粉后15 d为WI7120果实出现空腔的关键时期，此时，9930果实果肉和心皮的GA含量分别为50.77和62.00 μg/mL，差异极小。而WI7120果实心皮的GA含量为485.46 μg/mL，远大于果肉（286.77 μg/mL）。可见，果肉与心皮的GA含量差异小，导致9930果实果肉和心皮细胞膨大倍数差异小，而WI7120果实心皮的细胞膨大倍数远大于果肉。推测WI7120果实空腔性状的出现可能是WI7120果实果肉和心皮细胞膨大的差异导致。WI7120果实中ZT含量高于9930，观察果实横切面细胞密度差异，发现果实发育后期WI7120果实的细胞密度大于9930，且WI7120果实的果径大于9930。表明WI7120果实空腔性状的出现可能受到GA和ZT的调节。

2.4 黄瓜WI7120果实空腔等级与各部位指标的相关分析

为进一步说明WI7120果实生长发育过程中空腔等级与果实各部位激素含量间的关系，将WI7120果实的空腔等级与不同部位激素含量及相对含量进行相关分析。结果（表3）发现，WI7120果实果皮的GA和ZT含量均与空腔等级呈显著正相关，GA/ZT与空腔等级呈显著负相关，细胞大小与空腔等级呈极显著正相关（P＜0.01，下同），表明果皮细胞的生长受到GA和ZT的共同调节，进一步影响果实空腔等级；同时，果肉细胞密度与空腔等级呈极显著负相关，心皮细胞大小与空腔等级呈极显著正相关。

表3 黄瓜品系WI7120果实空腔等级与各部位指标的相关分析Table 3 Correlation analysis between hollow grade and related indexes in different parts of cucumber WI7120 fruit

3 讨论

在果实生长发育过程中，植物内源激素均参与对细胞分裂和膨大的调控过程，IBA、GA、ZT和ABA是果实发育最主要的调控因子（Kumar et al.，2014）。黄瓜是一种十分重要的设施栽培蔬菜（牛志红等，2020），研究黄瓜果实内源激素与果实空腔形成的关系，可为黄瓜优质品种的选育提供技术支持。甜瓜果实相关研究发现，发育后期生长素由种子转移到果肉促进果实生长（Lee et al.，1997）。本研究中，2个黄瓜品系中除WI7120果实的心皮IBA含量在授粉后15 d后呈下降趋势，其余各部位均呈上升趋势，可能是种子中IBA转移至果肉而非心皮所导致。表明WI7120果实心皮在7～15 d高含量的IBA是导致WI7120果实心皮细胞由近圆形变为扁长形的原因。9930果实ABA含量在授粉后15 d以后迅速增加，该结果与赵晓晓（2019）研究结论ABA在果实转色期后迅速增加一致。

本研究中9930果实授粉后15 d GA含量高于授粉后7 d，其变化与汤佳（2015）、潘丹丹（2009）测得幼果中GA高于成熟果实结果一致；15 d后，9930果实GA增加，这是由于授粉后15 d及以后，9930黄瓜种子开始发育，而正在发育的种子是GA的丰富来源（Liu et al.，2016）。WI7120果实GA含量在授粉后15 d高于7 d，可能是不同品种黄瓜种子发育时期不一致导致。比较不同发育时期的果实横纵径变化，发现WI7120果长和果径的变化规律分别呈单S和双S形曲线变化，该结果与杨悦（2018）研究结果一致，而9930果实果径的发育规律与其不符，但与王燕（2015）的玻璃温室中9930果实果径的增长呈单S曲线变化结果一致，可能是由于在设施栽培环境下，黄瓜果实在生长发育过程中易早熟，果长和果径在花后增长迅速。研究发现，细胞分裂素运转至果实后对果实的最后大小起着决定性作用（潘丹丹，2009）。本研究发现果皮的GA和ZT含量均与空腔等级呈显著正相关，表明果皮中GA和ZT共同调节果实果皮细胞的大小及密度以控制果径，进而影响果实空腔等级。本研究通过果实观察横切面细胞密度差异，发现ZT含量高的果实横径大，与徐婧等（2020）观察果实纵切面的细胞差异，发现CsSUN与CsLNG1通过控制黄瓜果实细胞数量的增加调控黄瓜果实大小结果一致。WI7120果实的果长和果径均与空腔等级呈极显著正相关，此结论与Wang等（2020）研究结论吻合，表明WI7120果实中，ZT通过影响果实细胞密度来影响果径，进一步影响着果实空腔等级。

WI7120果实心皮中高含量的IBA和GA导致其细胞由近圆形膨大为扁长形。WI7120果实心皮细胞形状的变化可能是由于心皮细胞壁在果皮方向的（纵向）延展速度大于相邻心皮方向的（横向）延展速度。在授粉后6～15 d，WI7120果实近圆形的果实形态发育过程中，细胞膨大对其果实膨大的促进作用大于细胞分裂，心皮细胞可能通过细胞壁间隙的增大来应对心皮细胞壁纵向延展速度大于横向，以维持WI7120果实近圆形的果实形态。随着果实发育，细胞壁间隙增大，进而心室分离，WI7120果实表现出空腔性状。授粉后15 d以后，WI7120果实心皮GA减少，而果肉GA增多，即心皮细胞膨大速度减慢，果肉细胞膨大速度增大。由于果实膨大，果肉细胞膨大的主要方向为果皮方向，因此对其内部心皮产生向外的拉扯力，心室进一步分离，空腔等级加大。9930果实在授粉后15 d内，果实各部位ZT缓慢增加，果肉细胞中GA含量与心皮细胞差异小，细胞膨大速度接近，且其细胞均保持近圆形，无细胞间隙或细胞间隙极小。授粉后15 d后，其果肉与心皮的细胞GA含量基本一致，因而其果肉和心皮细胞膨大速度接近，彼此间无拉扯作用或拉扯极小，因而无空腔性状出现。