Gilbert综合征与Crigler-Najjar综合征Ⅱ型患者UGT1A1基因多态性分析

刘念晨， 白 洁， 梁 晨， 白 丽， 刘 霜， 段钟平1b,， 郑素军

1 首都医科大学附属北京佑安医院 a.肝病中心一科， b. 肝病中心四科， 北京 100069；2 肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室， 北京 100069

遗传性非结合性高胆红素血症，包括Crigler-Najjar综合征Ⅰ型(CN-1)、Crigler-Najjar综合征Ⅱ型(CN-2)和Gilbert综合征(GS)，都是由胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)基因突变所引起的。在肝脏中，非结合胆红素(IBil)在UGT1A1的催化下与葡萄糖醛酸结合，生成结合胆红素(DBil)。当UGT1A1基因突变导致酶活性降低或丧失时，IBil因无法转化为DBil而在体内蓄积。

CN-1极为罕见，患者血清胆红素水平可达30 mg/dL以上(30～50 mg/dL，513～855 μmol/L)，在此水平下，患者常伴有胆红素脑病的危险[1]。CN-2的发病率约为1/100万，是血清胆红素水平介于6～20 mg/dL(102.6～342 μmol/L)的中度高胆红素血症[2]。GS为最常见的遗传性疾病之一，血清胆红素水平介于1～5 mg/dL(17～85 μmol/L)，表现为轻度高胆红素血症。CN-2与GS的交界值通常为6.0 mg/dL(102.6 μmol/L)，但有许多患者的胆红素水平接近这一界值。有研究[3]认为，血清胆红素水平随基因型从GS到CN-2连续变化，但由于突变和基因多态性的结合，许多患者在两个表型之间表现出中等水平的血清胆红素，临床上很难明确区分这两种表型。本文重点研究了GS和CN-2两种表型之间UGT1A1基因突变位点的差异。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2010年1月1日—2019年12月31日就诊于首都医科大学附属北京佑安医院的GS与CN-2患者临床资料。

1.2 观察指标 所有患者均在本院检测了血常规及肝功能，包括ALT、AST、TBil、DBil、IBil、ALP、GGT、TP、Alb、Glb等指标；于本院或外院完善Coombs试验以除外溶血，并除外病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝损伤及酒精性肝炎等导致胆红素升高的情况。所有患者均进行UGT1A1基因检测。以血清TBil水平102.6 μmol/L为临界值区分GS与CN-2患者[2-3]。

1.3 检测方法 血常规、肝功能等参数均采用本院检验科标准。采集患者空腹12 h的抗凝全血与血清用于提取DNA。基因检测采用聚合酶链反应扩增后直接DNA测序的方法，对UGT1A1基因苯巴比妥反应增强元件(PBREM)区、启动子TA盒以及5个外显子进行遗传分析。

1.4 伦理学审查 本研究方案经由首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会审批，批号：LL-2019-029-K。

1.5 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件进行数据处理。对于缺失值小于样本总量10%的参数，分别为年龄(n=1，0.72%)、ALP(n=3，2.17%)、GGT(n=2，1.45%)、TP(n=6，4.35%)，使用期望最大化法进行处理。不符合正态分布的计量资料以M(P25～P75)表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料两组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。使用在线软件SNPStats(https://www.snpstats.net/start.htm)进行连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)和单倍型的分析，强LD被定义为|D′|和r2均>0.8，中度LD被定义为|D′|>0.8且r2>0.4。

2 结果

2.1 一般资料 共选取符合纳入条件的患者138例，其中GS组109例，CN-2组29例。138例患者中，男115例，女23例，发病年龄9～72岁。CN-2组患者中女性比例、TBil、IBil水平较GS组更高，而GS组年龄、TP与Alb水平高于CN-2组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表1)。

表1 GS组与CN-2组一般资料比较

2.2 基因突变发生情况 138例患者均存在基因突变，突变位点共发生频次563次。突变主要发生在启动子上游PBREM区域-3279T>G突变(104例，75.36%)、-3152G>A突变(82例，59.42%)和启动子TATA 盒TA 插入突变(88例，63.77%)，以及编码区1号外显子上的c.211 G>A(p.G71R)突变(66例，47.83%)，突变形式可表现为纯合及杂合突变，综合所有患者对于出现的突变位点频次进行分析，每个突变位点的发生情况见表2。GS组在PBREM区域-3279T>G位点、-3152G>A位点及启动子TATA 盒(TA)6>(TA)7突变的比例高于CN-2组，而CN-2组在c.211位点和c.1456位点的突变比例高于GS组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

表2 UGT1A1基因各突变位点发生情况

2.3 单倍型和双倍型分析 对UGT1A1基因不同变异间的LD进行单倍型分析，结果显示(TA)6>(TA)7与-3152G>A之间存在强LD(|D′|>0.8，r2>0.8)，(TA)6>(TA)7与-3279T>G、-3152G>A与-3279T>G、(TA)6>(TA)7与c.211G>A、-3279T>G与c.211G>A存在中度LD(|D′|均>0.8，r2均>0.4)(表3)。在138例患者中，频率>1%的单倍型共有9种，详见表4，它们共同构成了25种双倍型，涵盖135例患者(97.8%)；其中单倍型1、3、4在GS和CN-2两种表型间的频率差异均有统计学意义(P值均<0.05)。图1所示为25种双倍型中频率>1%的19种组合及其对应的TBil水平(log10转换后)，其中双倍型2/4、3/4、4/4、4/5、4/8对应的TBil水平相对更高。

表3 UGT1A1基因不同变异间的LD分析

表4 UGT1A1基因单倍型分布

3 讨论

本研究对GS患者与CN-2患者一般资料的组间分析结果显示，GS组年龄、TP与Alb水平明显高于CN-2组(P值均<0.05)。可能的原因是CN-2患者往往因黄疸水平高，就诊年龄更早。另外，最近研究[4]发现胆红素作用具有两面性——轻度升高的血清胆红素具有更好的抗氧化作用，而过高的血清胆红素水平则具有促氧化作用。GS是一种良性的轻度高胆红素血症，目前研究[5-7]认为该病一般不需要治疗，并且GS患者罹患包括心血管疾病、2型糖尿病和代谢综合征在内的各种疾病概率更低。而CN-2患者TP与Alb水平降低则表明其肝脏合成功能已经在一定程度上受到了影响。

注：每种双倍型对应的TBil水平表示为均数±标准差，虚线为TBil水平102.6 μmol/L对应的对数值。

本研究的主要目的是分析GS组与CN-2组UGT1A1基因突变位点的差异。在单个位点突变频率的分析中，GS组发生PBREM区域及启动子TATA 盒(TA)6>(TA)7突变的比例高于CN-2组，而CN-2组在c.211位点和c.1456位点的突变比例高于GS组，这与文献报道的相一致。大多数CN-2患者有外显子区域的纯合错义突变或复合杂合突变，酶活性降低到正常水平的10%以下[8]，而GS患者则常有启动子、增强子和编码区的突变，导致肝脏UGT1A1活性降低到正常的30%以下[9-10]。在对不同突变位点的LD分析中，(TA)6>(TA)7和-3152G>A之间存在强LD，(TA)6>(TA)7和-3279T>G、-3152G>A和-3279T>G、(TA)6>(TA)7和c.211G>A、-3279T>G和c.211G>A之间存在中度LD，这也可以解释单倍型频率分析的发现：在GS组中，单倍型1[-3279G—-3152A—(TA)7]出现的频率高于CN-2组，而单倍型3(c.1456G)和单倍型4(c.211A—c.1456G)的频率低于CN-2组(P值均<0.05)。

在138例患者中，频率>1%的单倍型共有9种，它们组合可构成25种双倍型，涵盖了135例患者(97.8%)。分析25种双倍型中出现频率>1%的19种组合以及与其对应的TBil水平(图1)，可见双倍型2/4、3/4、4/4、4/5、4/8对应的TBil水平相对更高，其中位水平都在102.6 μmol/L以上，这也从另一个方面印证了突变位点c.211和c.1456在CN-2中出现的比例更高，以及单倍型3和4在CN-2中有更高的频率，可以认为这两种单倍型参与组成的双倍型对胆红素水平有比较大的影响。

综上所述，GS和CN-2患者的常见UGT1A1基因突变位点以及主要单倍型有所不同，在CN-2中包含常见单倍型(c.1456G和c.211A—c.1456G)的双倍型可对应更高的TBil水平。这有助于更好地区分胆红素水平相近的两种表型，常见单倍型/双倍型的检出也可以提高诊断效率。

本研究有一定的局限性。首先，研究只纳入了高非结合胆红素血症人群，缺少性别、年龄相匹配的正常对照。第二，研究的样本量较小，且对疾病的重视程度等因素在一定程度上影响了患者的性别、年龄分布，需要更大的样本量以及更接近1∶1的性别比例来进一步验证本研究得出的结论。第三，患者的胆红素水平是波动的，长期禁食、发烧和剧烈运动等均可导致胆红素水平出现较大变化[11]，尽管已经标准化采血(清晨空腹10～12 h后采血，避免剧烈运动)，但仍有一些不可控因素会影响胆红素水平。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：刘念晨负责收集数据，资料分析，撰写论文；白洁、梁晨负责标本整理，收集数据，分析测序结果；白丽、刘霜负责基因检测报告的核对及发布；段钟平负责拟定写作思路；郑素军指导撰写文章并最后定稿。