扶正化瘀方通过改变急性肝损伤小鼠模型肝脏CD8+T淋巴细胞表型功能预防肝纤维化的价值分析

黄 辉， 徐列明,3， 平 键， 周 扬

1 上海中医药大学附属曙光医院， 上海 201203； 2 上海中医药大学肝病研究所， 上海 201203；3 肝肾疾病病证教育部重点实验室， 上海 201203；4 上海中医药大学附属曙光医院脑科学研究所， 上海 201203 5 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 治未病中心， 上海 200437

肝纤维化是许多慢性肝病，包括慢性乙型肝炎和丙型肝炎、酒精滥用、胆道梗阻、自身免疫性疾病、遗传性血液色素沉着症和非酒精性脂肪性肝病等[1]伴随的病理变化。肝纤维化最终可导致肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。为了降低肝硬化和肝癌的病死率, 逆转肝纤维化是十分必要的[2]。对肝纤维化的治疗与研究在现阶段仍处于十分重要的地位。

肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化产生的中心事件。肝纤维化是伤口愈合过程异常的原因，导致HSC不断活化，肝脏瘢痕组织形成。而免疫系统特别是T淋巴细胞、NK细胞通过细胞因子参与了HSC的活化和凋亡的调控。其中T淋巴细胞介导的免疫应答涉及CD8细胞毒性T淋巴细胞, 主要通过主要组织相容性复合体Ⅰ类分子识别感染细胞上的病毒抗原[3-4]。许多针对HBV的治疗性疫苗和免疫治疗策略, 主要集中于如何诱导适应性免疫应答，尤其是涉及特定T淋巴细胞的适应性免疫应答，因此，确定HBV特异性效应CD8+T淋巴细胞对HBV感染控制的影响至关重要。为了更确切地揭示扶正化瘀方抗肝纤维化的免疫调节机制，本文研究经扶正化瘀方干预后小鼠肝脏CD8+T淋巴细胞对HSC的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7周龄SPF级雄性C57BL/6NCrl Vr小鼠，购自北京维通利华动物有限公司[生产许可证：SCXK(京)2016-0011]，饲养于上海中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2014-0008。予以普通饮食饮水。

1.2 药物与试剂 四氯化碳(CCl4)和橄榄油均购自国药集团化学试剂有限公司。扶正化瘀方干粉，批号：180308，由上海现代中医药股份有限公司提供。将分析纯级别的CCl4与橄榄油按照1∶9比例混合，配制成浓度为10%的CCl4混合溶液。RPMI-1640，Hyclone；高糖DMEM培养基(1×)，Corning；胎牛血清(FBS)，Corning；PercollTM，GE Healthcare公司；Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc BlockTM)、FITC Hamster Anti-Mouse CD3e、BV421 Rat Anti-Mouse CD45、PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse CD4、APC Rat Anti-Mouse CD8a、PE-CF594 Hamster Anti-Mouse CD28，均购自BD公司；Cell to cDNA Kit PLUS、2×SYBR Green qPCR Mix，EZ Bioscience公司。BSA，上海碧云天生物技术有限公司。根据相关文献[5]制备扶正化瘀方药物血清。

1.3 主要仪器 生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司；细胞培养箱，Thermo Fisher Scientific公司；小型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；低温高速离心机，JOUAN公司；全自动细胞计数仪、细胞计数板、cDNA逆转录仪，BIO-RAD公司；PCR扩增仪，ABI公司；流式细胞分选仪(型号：BD FACSAriaTM Cell Sorter)，BD公司。

1.4 造模 参照文献报道，对模型小鼠给予10%的CCl4腹腔注射12 h，制备急性肝损伤模型。

1.5 分组及干预 动物实验：将18只C57雄性小鼠随机分为正常组、模型组、扶正化瘀方组，每组6只。适应性喂养1 周。扶正化瘀方组提前给予扶正化瘀方灌胃5 d。实验开始前1天晚上给予模型组和扶正化瘀方组小鼠浓度为10%的CCl4，以2 mL/kg体质量的剂量腹腔注射。染毒12 h后，2%戊巴比妥麻醉，腹主静脉取血，无菌条件下，摘取肝脏用于病理观察和淋巴细胞分选。之后行流式细胞分选术。小鼠肝星状细胞株(JS 1)以10%血清培养，之后与CD8+T淋巴细胞以2∶1比例培养于96孔板中，重复3批。

1.6 检测指标及方法 (1)使用微板法检测小鼠血清中ALT、AST含量。(2)将小鼠肝组织在10%中性甲醛中浸泡固定48 h后逐级酒精脱水，二甲苯透明，56 ℃石蜡包埋，4 μm厚切片，用于HE染色，光镜下观察。(3)qPCR检测JS 1中纤维状胶原蛋白Ⅰ(Collagen type Ⅰ，Col.Ⅰ) mRNA和α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) mRNA的表达(表1)。按照EZ BioscienceTMqPCR SYBR Green Master Mix Protocol试剂盒进行qPCR检测实验。(4)使用美国BD公司流式细胞仪(BD FACSAriaTMCell Sorter)无菌分选小鼠肝脏中CD8+T淋巴细胞。

表1 qPCR引物列表

1.7 伦理学审查 本研究方案经由上海中医药大学实验动物伦理委员会审批，伦理审查号：PZSHUTCM190301014，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 CCl4急性造模后各组小鼠肝脏病理观察 HE染色显示，正常组小鼠肝小叶结构完整，肝窦无充血、出血，肝细胞排列整齐、形成肝板，门静脉周围及汇管区无明显炎症细胞浸润和肝细胞变性坏死。模型组小鼠肝组织结构紊乱，肝细胞多胞浆疏松、水样变性，散在气球样变，见灶性坏死。扶正化瘀方组小鼠肝细胞变性、坏死程度较模型组有所减轻(图1)。

图1 各组小鼠肝脏病理光镜观察(HE染色)

2.2 CCl4急性造模后各组小鼠血清ALT和AST水平变化 模型组的ALT和AST水平均显著高于正常组(P值均<0.000 1)，经扶正化瘀方预防用药5 d的扶正化瘀方组ALT升高的幅度明显小于模型组(P<0.001)(图2)。

图2 各组小鼠血清ALT和AST水平变化

2.3 各组肝脏相关细胞占总淋巴细胞比例 3组间总淋巴细胞、CD45、CD4-CD8+T、CD8+CD28-T比较差异均有统计学意义(P值均<0.01)(表2)。

表2 各组肝脏相关细胞占总淋巴细胞比例

2.4 JS 1与CCl4急性肝损伤小鼠肝脏CD8+T淋巴细胞共培养24 h及48 h后α-SMA mRNA、Col.ⅠmRNA的表达变化

2.4.1 α-SMA mRNA 对照组(JS 1单培养)、正常组(JS 1与正常小鼠肝脏的CD8+T淋巴细胞共培养)、模型组(JS 1与CCl4急性肝损伤小鼠肝脏的CD8+T淋巴细胞共培养)、扶正化瘀方组(经扶正化瘀方治疗的CCl4急性肝损伤小鼠肝脏分离的CD8+T淋巴细胞与JS 1共培养)在24 h时JS 1表达α-SMA mRNA相似，各组间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。但是共培养到48 h时，与对照组和正常组相比，模型组α-SMA mRNA的表达均明显升高(P值均<0.01)。扶正化瘀方组的α-SMA mRNA表达升高则不明显，与模型组间的差异具有统计学意义(P<0.01)(图3)。

图3 JS 1与各组小鼠肝脏CD8+ T淋巴细胞共培养后表达α-SMA mRNA的变化

2.4.2 Col.Ⅰ mRNA 在共培养24 h时间点，与模型组相比，扶正化瘀方组的JS 1表达Col.ⅠmRNA明显下降(P<0.01)。在共培养到48 h时，与对照组和正常组相比，模型组JS 1表达Col.ⅠmRNA上升明显(P值均<0.001)；扶正化瘀方组JS 1表达Col.ⅠmRNA明显低于模型组和正常组(P值均<0.001)(图4)。

图4 JS 1与各组小鼠肝脏CD8+ T淋巴细胞共培养后表达Col.ⅠmRNA的变化

3 讨论

肝纤维化的发生机制相当复杂，其中HSC活化和凋亡受到免疫系统的调控，而细胞介导的免疫反应在造成肝损害方面尤为重要。肝脏富含先天免疫细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、炎症性单核细胞、NK细胞和自然杀伤T淋巴细胞, 参与炎症反应[6-7]。肝内淋巴细胞、NK细胞、自然杀伤T淋巴细胞和黏膜相关的不变T淋巴细胞被确定为肝脏先天免疫系统中的重要淋巴细胞[8-10]。

活化的HSC以表达α-SMA为标志，同时产生大量的细胞外基质。细胞外基质的主要成分是胶原蛋白, 与肝纤维化相关的主要是Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原。Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白在纤维化肝中明显增多。Col.Ⅰ的沉积是肝纤维化发病机制的一个关键特征[11]。

扶正化瘀复方是以中医理论为指导，根据“虚损生积”，即“正虚血瘀”的病机特点，由丹参、发酵虫草菌粉、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子(制)6味中药配伍而成。具有“益精养肝，活血祛瘀”的作用。研究[12-14]发现，扶正化瘀方可以通过降低炎症因子的表达，直接或间接调节机体免疫功能，从而发挥抗肝纤维化作用，利于肝脏功能的恢复。有研究[15]使用流式细胞术对荷瘤昆明小鼠T淋巴细胞亚群及肿瘤细胞凋亡开展研究，发现经扶正化瘀方中中药成分桃仁的重要化学组成成分桃仁总蛋白治疗后，明显改善荷瘤小鼠CD4+/CD8+的细胞失衡状态, 恢复机体正常的免疫状态, 从而发挥抗肿瘤的作用。这些资料均提示，扶正化瘀方可能通过调节机体的免疫状态来抗肝纤维化。

本实验对扶正化瘀方进行研究发现：与对照组相比，在24 h及48 h时间点，正常组α-SMA、Col.Ⅰ的mRNA表达变化均不太明显，这与课题组以往以健康者外周血CD8+T淋巴细胞与LX-2共培养和LX-2单培养24 h后的研究结果趋势一致[16]，说明正常CD8+T淋巴细胞并不刺激HSC的活化。

发生炎症反应的慢性肝炎患者由于肝脏内CD8+T淋巴细胞过度存在，不能清除抗原，致使炎症反应持续存在，促使CD8+T淋巴细胞活化，导致HSC的活化，最终导致纤维化的发生[17]。但是一项Meta分析[18]发现，CD8+T淋巴细胞或颗粒酶B产生的增加、CD4+T淋巴细胞的减少对滤泡性肿瘤预后十分有利，且CD8+T淋巴细胞可能是滤泡性肿瘤良好预后的标志性指标。Klametha等[19]对140例病毒感染和外周T淋巴细胞瘤患者外周血行流式细胞术后发现，其CD3+、CD8-、CD7-T淋巴细胞会反应性增加。而在HCV患者经过直接抗病毒药物治疗后，CD8+T淋巴细胞衰老及功能指标有所改善，利于肝纤维化治疗[20]。是否因为不同疾病中CD8+T淋巴细胞表型发生改变，故而其持续增加在不同疾病中所发生的作用也不尽相同？那么CD8+T淋巴细胞在小鼠CCl4急性肝损伤模型中是产生何种作用值得思考。

本实验对C57小鼠预防给药扶正化瘀方5 d后再造模，获得成功。病理观察提示：经扶正化瘀方预先用药后，扶正化瘀方组小鼠肝细胞变性、坏死程度较模型组均有所减轻；对小鼠血清检测发现：扶正化瘀方组小鼠AST水平变化与模型组相似，但是ALT升高的幅度明显小于模型组，T淋巴细胞比例降低。以上结果提示，扶正化瘀方用药5 d，已显示保护肝细胞的药效。

将CD8+T淋巴细胞与JS 1共培养24 h，模型组的CD8+T淋巴细胞尚未显示出对JS 1的明显影响，但共培养到48 h，其促进JS 1活化的作用十分明显，该组JS 1表达α-SMA mRNA和Col.Ⅰ mRNA远高于对照组和正常组。说明扶正化瘀方预先给药5 d能显著减轻CCl4所致的小鼠急性肝损伤，扶正化瘀方能够转变肝脏的CD8+T淋巴细胞，使之由激活HSC促进肝纤维化，转变为抑制HSC活化，并且随着共培养时间的延长，抑制HSC活化的作用更加显著，进而减缓纤维化进程，甚至有可能逆转纤维化。这一结果与课题组以往研究[21]中，扶正化瘀方有效组患者外周血CD8+T淋巴细胞能显著减少共培养的LX-2中α-SMA mRNA的表达(P<0.05)，而扶正化瘀方无效组患者外周血CD8+T淋巴细胞这种作用不明显的结果相一致。扶正化瘀方经治小鼠肝脏的CD8+T淋巴细胞与JS 1共培养48 h，抑制了JS 1的活化，可能是CD8+T淋巴细胞与共培养的JS 1直接接触的结果。此结果与临床扶正化瘀方治疗有效患者外周血CD8+T淋巴细胞及其亚群通过调节细胞因子的分泌，抑制共培养的HSC活化的观察结果不一致[16]。

以上研究结果均提示扶正化瘀方药物血清可能通过诱导小鼠肝脏CD8+T淋巴细胞抑制共培养的JS 1活化，这种抑制作用可能主要不是通过细胞因子调控的，但尚不能明确区分药物对HSC的直接或间接的调控作用。

囿于现阶段分选技术的限制，如采用流式技术分选耗时长、对细胞损伤较大，影响活率和得率；目前市场上无快捷分离的CD28磁珠试剂盒可在小鼠应用，故动物实验暂时无法进一步研究CD8+T淋巴细胞亚群对HSC的调节作用，期待以后能在人肝脏中开展后续研究。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：徐列明、周扬、平键负责课题设计，拟定写作思路；黄辉参与收集数据，资料分析，撰写论文；徐列明、周扬负责修改论文，指导撰写文章并最后定稿。