胆道菌群导致原发性肝内胆管结石形成机理的研究进展

任江平， 邱锦飞， 邹 杨， 蔡晓蓓， 徐承雷， 李 江

昆明医科大学第一附属医院 肝胆外科， 昆明 650032

原发性肝内胆管结石(primary intrahepatic stones, PIS)一般是指结石在左、右肝管汇合处近端的肝内胆管发生，但不包括从胆囊内排出并进入肝内胆管的结石，也不包括继发于损伤性胆管狭窄、胆管囊肿、胆管解剖变异等其他胆道疾病所致的肝胆管结石[1-2]。肝内胆管结石的成分主要是棕色胆色素结石。日本学者[3]进行一项持续40余年共7次流行病学调查，研究结果显示肝胆管结石主要是胆色素结石，胆固醇结石所占比例较小，为5.7%～13.1%。在中国、日本等许多亚洲国家肝内胆管结石均为常见疾病。我国肝内胆管结石年发病率为2%～2.5%[4]，主要集中在长江流域地区、东南沿海和西南的小部分地区。尽管近年来手术切除率显著提升，但因PIS病情迁延、复杂，治疗后复发率高。近期有研究[5-6]报道，肝内胆管结石经过初始治疗后，结石的残留和复发率依然较高，这使得部分患者不得不再次或多次手术，术后仍然反复复发，导致门静脉高压症、胆汁性肝硬变和肝内胆管局部恶变等[7]。因此，了解PIS的病因和发病机制，才能更合理地选择防治策略[8]。PIS在病理学上表现为含有结石的肝内胆管上皮慢性炎症，胆管周围腺体增生和壁纤维化的特点[9]。过去有观点[10]认为结石的发生主要与胆道感染和胆道梗阻导致的胆汁淤积有关。随着进一步的研究发现存在着更多复杂因素，如胆道细菌的存在、肠道菌群失衡、寄生虫感染后的持续免疫反应、代谢缺陷、饮食习惯、环境改变和遗传等。这些因素均会干扰肝内胆管的胆汁成分和胆道流体力学改变，导致结石的形成。

细菌感染仍是PIS的关键因素之一，且被越来越多的研究证实。本文拟探讨细菌引起PIS的相关机理，为肝内胆管结石的治疗及术后复发预防提供参考。

1 细菌感染与PIS

1.1 PIS的细菌学检测手段 以往国内外均将正常的胆道视为一个无菌性环境[11]。近年来，随着对胆道微生态研究的深入，健康胆道无菌的观点遭受了挑战。Jiménez等[12]在健康猪的胆道中检测出细菌存在。之后Molinero等[13]首次在没有任何肝胆疾病个体的胆汁中检测到细菌群落。因此认为正常胆道或许存在一个微生态系统，若有胆道疾病致病因素存在，该微生态系统的平衡就会失调，如优势菌群变化、菌群多样性降低、微生物代谢改变等，从而引起结石发生。细菌和肝内胆管结石形成之间有着密切的联系。Tabata等[14]早在20世纪80年代研究发现，美国肝内胆管结石患者并发胆道感染的发生率高达96.3%，这在当时与日本、中国及其他东亚国家的报告相一致。以往通常使用培养基进行需氧和厌氧菌培养，或者应用PCR的方法鉴别出细菌。近年来，新一代高通量测序技术的出现打破了传统方法，可以从分子生物学角度研究微生物群体的所有DNA或RNA，对微生物群体的结构多样性及功能多样性有了更多的了解[15]。

1.2 PIS的细菌谱 有文献[16]报道20世纪50年代侯宝璋就提出细菌感染可能会导致肝内胆管结石，但其未进行后续研究。随着检测手段的逐渐成熟，国内外对PIS患者细菌谱的认识也在不断深入(表1)。

表1 肝内胆管结石菌群的相关研究结果

各研究报道的胆道菌群多样性及群谱并非完全一致，可能与检测手段、检测样本数量差异有关。较具有代表性的为2002年Chang等[19]对过去10年共1394例胆道感染患者的细菌谱进行了分析，其中肝内结石患者的胆汁细菌阳性培养率为67%，细菌谱以革兰阴性菌(74%)为主，主要为大肠杆菌(36%)、克雷伯氏菌(15%)，有少量的革兰阳性菌(15%)，如肠球菌(6%)、葡萄球菌等；极少量的厌氧菌也被发现，如类杆菌和梭菌。另有报道[25-26]肝内胆管结石患者胆汁及胆管黏膜中存在幽门螺杆菌感染。总体上，PIS胆道感染的细菌谱在国内外近30年来无较大变化，需氧菌中大肠杆菌、克雷伯氏菌、肠球菌、肠杆菌较为常见，而厌氧菌以梭菌和类杆菌较常见，一般厌氧菌都是伴随着需氧菌存在。现将肝内胆管结石细菌培养的细菌谱占比归纳如下(表2)。

表2 肝内胆管结石胆汁或结石细菌谱

由此可以发现，胆道菌群与肠道菌群谱有大量重合。上文中提到有研究者发现肝内胆管结石患者胆道系统中存在幽门螺杆菌感染也证实了胆道菌群和肠道菌群可能是相互联系的。本中心曾于2014年对胆囊结石患者的胆道核心菌群进行了鉴定和分析[27]，以胆囊结石患者的胆结石、胆汁及粪便的菌群为研究对象，结果显示胆道菌群与肠道菌群谱有大量重合，并探讨了胆道菌群和肠道菌群变化与胆结石形成的关系，从而对肝胆管结石的初始外科治疗更加规范[28]。然而，关于胆道菌群的来源至今还没有定论，目前普遍认为是肠道微生物群逆行感染的重要通路。细菌通过Oddi括约肌入侵胆道导致感染，这被认为是最主要因素[29]。此外，有学者认为细菌通过门静脉入侵也是胆道感染的途径之一。

2 细菌在PIS发病中的可能致病机制

胆道细菌在人类色素性胆结石的发病机理和形成中发挥重要作用[30-31]，与胆囊结石、胆总管结石一样，PIS绝大部分为色素性结石，在这些患者的胆汁样本中细菌的16S rRNA检出率很高[32]。著名的Maki学说[10]阐述了胆道感染与结石具有密切关系，并指出感染胆汁中细菌产生的大量β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase, β-G)在结石形成过程中具有着重要的作用。具体机制如下：β-G能水解结合胆红素(conjugatebilirubin, CB)，将其分解为葡萄糖醛酸和非结合胆红素(unconjugatebilirubin, UCB)，而后UCB与钙离子相结合形成胆红素钙。目前已有大量研究发现许多菌群能通过β-G途径参与PIS形成，可产生β-G的细菌主要为大肠杆菌，其次为部分厌氧菌，如脆弱类杆菌和梭形杆菌等，少数其他需氧菌(如幽门螺杆菌等)、兼性需氧菌也可产生。这种由胆道感染细菌产生的β-G，称为细菌性β-G或者外源性β-G；另一种β-G由肝细胞、肝内胆管上皮细胞(intrahepatic bile duct epithelial cell，HIBEC)产生，称为组织性β-G或者内源性β-G，当组织破坏和细胞解体时被释放。随着对内、外源性β-G与PIS之间关系的深入研究，发现组织性β-G与色素性结石形成关系更为密切[33]。此外，PIS细菌培养阳性率很高，但仍有极少部分的标本中并未检测到细菌，提示可能是患者组织性β-G发挥作用。下面将现阶段国内外对菌群与PIS关系的研究进行总结并绘制机制图(图1)。

内源性β-G可将CB分解，在促进胆色素结石形成过程中起重要作用。其机制可能与革兰阴性杆菌产生的内毒素有关，内毒素引起炎症反应，导致胆管上皮细胞损伤和内源性β-G分泌增多，从而促进结石形成[34](图1途径1)。

随着对肝内胆管结石发病机制的深入研究，发现胆管周围存在腺体组织，这是肝内胆管结石典型的病理特征，腺体的黏液腺泡均含有丰富的中性、羧化和硫酸化黏液糖蛋白。2013年Yang等[35]发现含结石的HIBEC因炎症刺激分泌的黏蛋白明显高于正常胆管，黏蛋白分子在肝内胆管黏膜表面形成一层胶体凝胶，充满胆管腔内，可造成胆汁淤滞和机械性胆道梗阻，从而为结石的形成提供条件。其内主要包括唾液酸蛋白和硫黏蛋白等酸性物质[36]，酸性物质会使胆汁环境的pH值降低，导致胆红素钙和UCB的溶解度明显下降，从而析出结晶导致结石形成，酸性环境亦利于有些细菌如幽门螺杆菌等生长，从而继发细菌感染。此外，过多的唾液酸蛋白、硫黏蛋白等分子分泌后可能会在肝内胆管黏膜表面形成一个特殊的微环境，该微环境是一个网状结构，脱落的细菌、细胞上皮和胆汁中的钙盐脂质等物质容易镶嵌在其中，从而聚集导致结石形成、复发。PIS与胆管狭窄之间存在恶性循环，结石本身及其继发的胆道感染均可刺激胆管壁持续增生，导致CPC和胆管狭窄的发生，CPC的反复发作反过来会产生大量的黏蛋白促进新结石的形成，或者诱导胆管狭窄和胆汁淤积[37](图1途径2)。

注：LPS，脂多糖；CPC，慢性增殖性胆管炎；Cag A，细胞毒素相关蛋白；Vac A，细胞空泡毒素。

此外，大部分细菌如大肠杆菌、克雷伯氏菌等均会产生磷脂酶A1，可将胆道磷脂酰胆碱分解为游离脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱，因其具有疏水性，一方面会使脂肪酸钙快速沉积，另一方面会使HIBEC分泌大量的黏蛋白，进而导致结石形成(图1途径3)。

正常情况下，胆囊内壁作为黏膜屏障，具有预防胆囊结石形成、维持正常生理功能等作用。胆囊结石患者的胆囊内壁被破坏了局部的黏膜屏障[38]，同时会继发其他细菌感染，细菌产生的外源性β-G大量分泌有利于结石的形成。由于胆囊黏膜和肝内胆管上皮的相似性，可推测肝内胆管黏膜屏障受到破坏可能存在相似途径促进结石形成(图1途径4)。

胆道与十二指肠菌群之间具有一定的相似性和关联性[39]。幽门螺杆菌在较低浓度的胆汁酸中存活，通过十二指肠后依然能够定植、生长。2007年李霆等[40]发现幽门螺杆菌不仅与大肠杆菌等其他细菌一样能通过内源性β-G途径参与PIS的形成，也能通过自身产生的相关代谢产物导致结石形成。2006年包文中[25]通过对PIS患者胆汁及胆管黏膜进行检测，证实了幽门螺杆菌和幽门螺杆菌感染相关蛋白存在：在胆汁中检测出Cag A、Vac A、尿素酶A及尿素酶B等多种细菌产物。除了幽门螺杆菌，大肠杆菌等细菌也能分泌大量Cag A、Vac A等代谢产物，在PIS患者体内可作为一种促成核因子导致结石形成和复发，但其具体致病机理目前暂无进一步研究(图1途径5)。

2000年曾勇等[41]对比胆汁、血清和胆囊免疫球蛋白分泌细胞在成石过程模型中的变化，证实胆汁免疫球蛋白含量与细菌感染密切相关。正常情况下胆管处于“防御”和“损伤”的动态平衡，即成核和抗成核蛋白共存,通常抗成核占优势地位，被胆道细菌感染后这一动态平衡被打破，具体机制可能是胆管内水分吸收障碍，导致蛋白质浓度升高；此外，大量分泌细胞生长后，一方面会导致强烈的炎症反应，损害胆管黏膜，另一方面成核蛋白增加，为结石的形成创造了良好的条件(图1途径6)。

在PIS患者中，胆道细菌感染后会产生大量的UCB，与钙离子结合从而形成胆色素结石。研究[42]表明，胆汁酸一定水平上能防止胆色素结石形成，具体机制可能是在胆汁中的其酸性能增加胆红素钙溶解度。但有学者[10]通过对肝内胆红素结石与胆总管结石的胆汁成分分析比较发现：肝内结石总胆汁酸水平比胆总管结石低，其细菌代谢产物结合胆汁酸(如甘氨胆酸、牛磺胆酸)含量较高，说明当胆汁酸成分改变或钙离子/UCB水平增加，会导致胆管内胆红素钙溶解度下降，从而形成结石(图1途径7)。

有研究[43-45]证实，β-G的上调可能与LPS的代谢有关。LPS是一种内毒素，位于革兰阴性杆菌细胞壁的最外层。2007年孙韶龙等[43]发现LPS可以增加小鼠肝脏细胞β-G mRNA的表达，从而参与胆色素结石的发病。目前认为可能的机制是胆道感染菌群产生LPS后，与脂多糖结合蛋白(LBP)结合形成LPS-LBP复合物，然后与肝细胞、外周血单核细胞膜表面的CD14相结合，从而能够被CD14转运到细胞膜上的Toll样受体4(Toll like receptor 4, TLR4)，以实现跨膜传导。当LPS与TLR4结合后通过一系列的信号级联反应，激活核因子-κB(NF-κB)，活化的NF-κB可以穿梭核膜进入核内，最终细胞内控制β-G的基因(GUSB基因)被启动，从而转录大量的mRNA，合成更多的β-G蛋白。以上从分子水平上阐述了LPS通过相关途径合成和释放大量的内源性β-G。LPS也可激活HIBEC的TLR4/NF-κB/c-myc信号通路H和PKC/NF-κB/c-myc信号通路实现内源性β-G大量表达[44-45]。

迄今为止，相关研究已检测出20多种黏蛋白，分布于机体各个器官，肝内主要含6种黏蛋白，分别为MUC1、MUC2、MUC3、MUC5AB、MUC5AC以及MUC6[46-47]，由肝内胆管黏膜及周围腺体分泌，PIS患者胆管分泌的上述黏蛋白较正常肝内胆管多。LPS刺激黏蛋白MUC2、MUC5AC上调的研究主要集中于呼吸道，其机制可能是LPS通过与TLR4结合从而转录和翻译多种致炎因子，例如TNFα、IL-6等，从而诱导MUC5AC表达。Shen等[48]将呼吸道上皮细胞暴露于LPS后，量化了SPC-A1(一种人呼吸道黏膜下腺细胞系)中MUC5AC表达水平的变化，导致MUC5AC表达增加(EGFR-p38/JNK信号传导通路)。由于呼吸道上皮和肝内胆管上皮在胚胎学具有同源性，可推测LPS诱导肝内胆管分泌黏蛋白增多可能存在相似途径。此外，一些信号通路也为药物靶点治疗PIS提供了潜在的新策略。如LPS可通过多种分子途径刺激MUC5AC过表达[49]，p38丝裂原活化蛋白激酶MAPK(p38MAPK)通路参加了PIS的形成过程[50](图2)。

图2 LPS诱导结石形成可能的机制

以上探讨了促结石形成的机理，与之作用相反的，部分杆菌菌株具有胆汁盐水解酶活性，能够阻止肝胆管结石的形成[51]。国外研究[52]发现部分胆道细菌产生的胆盐解离和多重耐药外排泵蛋白均与细菌的胆汁耐受有关。2016年叶福强[53]对胆总管结石的胆汁样本进行宏基因组学分析，发现胆汁细菌中有13个菌种能够编码胆盐水解酶，30个菌种能够编码外排泵蛋白，但目前暂无研究报道PIS也有类似机制。此外，中间普雷沃菌和粪肠球菌产生的细菌黏液和生物膜，在胆汁耐受中也发挥重要作用[54]。

3 小结

综上所述，致石菌群对于PIS的形成过程，无论是致病菌的多样性，还是发病机制的复杂性，均表明了其举足轻重的地位。通过对PIS细菌谱的研究，可以为抗感染等相关用药治疗提供依据；而对于致石菌群导致PIS发病机制的认识，可以帮助从根源上防治肝胆管结石形成或复发，从而寻找更有效的临床治疗方法。然而，胆道菌群感染被认为是肝内胆管结石形成的一个极为重要的因素，但并非独立且唯一的因素，因其复杂性目前国内外学者尚未达成共识，因此，探索肝内各级胆管节段性和区域性分布的菌群，以及其代谢和微环境的相互影响有助于进一步探讨PIS形成机制，从而对该领域进行多中心、多学科、多角度、多层次的研究，以便对该病的治疗产生积极的影响。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：任江平、邱锦飞、李江负责课题设计，资料分析，撰写论文；邹杨、蔡晓蓓、徐承雷、李江参与收集数据，修改论文；李江负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。