猪重大育种价值基因及挖掘技术研究进展

方钱海，陈洪波，毕延震

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064；2.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北省家畜种业技术创新中心，武汉 430023)

长期以来，畜禽优良性状的调控机制一直是遗传育种领域关注的重点。随着基因组学、分子生物学和生物信息学等学科的发展，高通量测序技术、基因分型技术和基因编辑技术等的广泛应用，以及猪全基因组测序及单倍型计划的实施和完成，极大地推动了猪重大育种价值基因的鉴定[1-2]。作者就与猪肉质、抗病及繁殖性状相关的基因和挖掘技术进行综述，并对这些具有重大育种价值基因的利用提出相关建议和思考，供读者参考。

1 猪重大育种价值基因

1.1 肉质性状相关基因

猪肉作为世界上最大的肉类消费品类，其产量及品质是猪育种工作中的关键指标。随着分子生物学技术的发展，高密度SNP芯片、基因分型、猪的全基因组关联分析(genome wide association studies，GWAS)等多种技术得以快速发展和应用，通过对猪重要经济性状的分析发现了大量与猪肉质性状相关的基因，其不同的基因型或表达量能够直接或间接影响猪背膘厚、肌内脂肪含量及眼肌面积等重要的猪肉质评价指标。

1.1.1 胰岛素样生长因子 胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGFs)家族成员IGF1和IGF2主要在肝脏中表达合成，对肌肉细胞的生长分化具有重要的影响，且IGF2能够影响猪的肌纤维面积、肌内脂肪含量和背膘厚等肉质相关的重要性状[3-6]。IGF1和IGF2活化后与其相关受体如IGF-IR结合使Shc或IRS-1磷酸化，Shc可以磷酸化Sos蛋白，并在多种蛋白的参与下激活Ras-Raf-MEKs通路，IRS-1通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)刺激细胞分裂或通过PI-3K激活Akt通路，进而在mTOR和p70S6K作用下刺激蛋白质合成，且通过磷酸化叉头转录因子(FKHR)抑制其介导的对编码刺激肌肉分解代谢相关蛋白的刺激作用，从而增强蛋白质的合成和肌肉细胞的分化[3,7-9]，对肌肉质量平衡的维持具有重要的影响。研究发现，IGF2基因A3072G位点的突变能够显著影响波兰猪腰肉重量(WL)、火腿重量(WH)、胴体肉百分比(CP)等，还会影响其平均日增重(ADG)和采食量(DF)，且该位点的突变能够影响锌指蛋白6(ZBED6)与其的结合，消除二者间的相互作用，影响猪肌肉的发育[10-11]。

1.1.2 肌肉生长抑制素 肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)，又称生长分化因子8(growth and differentiation factor 8，GDF-8)，是转化生长因子β超家族的重要成员。作为肌细胞增殖和分化的关键负调控基因，MSTN能够抑制骨骼肌生长发育，并影响动物脂肪沉积，是导致动物“双肌”表型的关键因素[12-13]。研究发现，MSTN能够通过阻断AMPK/mTOR通路、抑制miR-128的表达，进而抑制其靶向的PPARγ/NF-κB信号通路，共同参与心肌调节[14]；还能够通过SMAD2/SMAD3调节TET1的活性，进而影响肌肉卫星细胞的分化[15]。通过激活SMAD4，MSTN能够增强miR124-3p的表达，抑制糖皮质激素受体，从而抑制3T3-L1细胞的脂肪分化[16]。但是其如何调节脂肪生成的分子机制仍存在争议，最近研究表明，MSTN通过SMAD2/SMAD3调节Jmjd3的表达影响肌细胞向脂肪细胞的转分化[17]；MSTN能够影响与猪脂肪酸代谢相关基因MEF2C和SCD5的表达，并通过MEF2C/miR222/SCD5级联信号影响脂肪酸去饱和，从而调节脂肪沉积[18]。

1.1.3 长链脂酰辅酶A合成酶 长链脂酰辅酶A合成酶(Acyl-CoA synthetase，ACSL)参与脂肪酸代谢过程，将其活化以进入包括脂肪酸β-氧化在内的各种代谢途径。在已知的5种ACSL基因亚型中，ACSL1基因在不同猪的肝脏、背最长肌和背部脂肪中均存在丰富的多态性，且其表达量及多态性在脂肪型与瘦肉型猪间存在显著差异[19]。ACSL1基因上游调控区c.-33 A>G位点不同基因型对二花脸猪活体背膘厚具有显著影响，证明ACSL1基因可以影响二花脸猪的皮下脂肪沉积[20]。ACSL3基因与肌内脂肪含量存在显著的相关性，且下调ACSL3基因mRNA的表达量会减少肌内脂肪细胞中甘油三酯的合成[21]。ACSL4基因与脂肪沉积、背膘厚和火腿重量等存在显著相关[22]，且敲低ACSL4基因会减少猪脂肪细胞中脂滴的积累[23]。

1.1.4 肥胖基因 肥胖基因(obsese，OB)表达产物为瘦素(leptin，LEP)蛋白，LEP是脂肪细胞响应体重或能量变化而分泌的蛋白类激素，与啮齿动物的摄食量有关[24]。研究发现，MC4基因能够影响动物体的脂肪储量，而LEP能够通过控制MC4受体的分泌量来调节动物体的体重[25]；在肥胖型猪3个脂肪区域中LEP转录物的表达水平显著上调[26]；在槐猪、杜洛克猪、江香猪的脂肪组织中LEP基因在背部脂肪、腹部皮下脂肪和板油中具有高表达量，过表达OB基因后，脂质代谢相关基因，如GPAM、ACACA、NPY等转录水平均显著上调，而DGAT、LPL、PPARγ等基因均极显著下调，其中PPARγ基因能增加高脂血症大鼠肝脏中甘油三酯的浓度[27-28]；在LEP过表达的猪皮下脂肪组织中SCAP、SREPB1、PPARγ、PLIN2基因的表达发生显著下调，且其前脂肪细胞脂滴数量和甘油三酯含量也显著降低[29]。

1.1.5 解偶联蛋白 解偶联蛋白(uncoupling protein，UCP)基因编码的解偶联蛋白家族位于线粒体内膜，包括6个成员。Zheng等[30]利用CRISPR/Cas9介导的非同源重组技术将外源UCP1基因定点敲入猪后发现，UCP1基因在猪白色脂肪组织中特异表达，能够减少脂肪沉积、增加瘦肉率、提高猪的抗寒能力。UCP2基因在猪背最长肌中的表达量与肌内脂肪含量及肉品质呈极显著相关[31]。UCP3主要在骨骼肌和脂肪中表达，参与机体产热、能量和脂质代谢、脂肪酸氧化、脂肪沉积等，与猪背膘厚呈显著相关[32]。与UCP2不同，UCP3基因表达量的提高有利于肌内脂肪沉积[33]，但与猪眼肌面积呈极显著负相关[34]。

1.1.6 其他相关基因 目前，与肉品质相关的研究报道已有很多，且通过对不同猪种的脂肪组织进行转录组分析已经得到了大量的数据，其中一些基因对皮下脂肪组织发育、背膘厚、脂肪沉积、肌内脂肪含量等具有显著影响，如PPARγ作为一种核激素受体和转录因子被证明在调节脂肪组织发育中起着重要作用，其启动子活性与瘦肉型和肥胖型2个品种猪皮下脂肪组织的发育有关[35]。生肌决定因子(MyoD)家族成员Myf5和MyoD1基因的多态性与猪背最长肌中的脂肪含量、水分含量及pH等显著相关[36]。作为构成骨骼肌和心肌主要结构的蛋白质，肌球蛋白重链(MYH)亚型MYH3基因与猪背最长肌和肌内脂肪含量具有极显著相关，且能够显著影响猪成纤维细胞肌内脂肪含量[37]。在对妊娠后期猪肌肉发育的全基因组交互分析中发现，MYH3与IGF2以及DLK1/MEG3基因间都存在显著关联，并参与肌肉发育[38]。Tao等[39]通过对7个中国地方猪种(包括藏猪、荣昌猪、成化猪等)和约克夏猪的脂肪和肌肉组织进行转录组分析得到了大量与猪经济性状相关的候选基因，包括LEP、SERINC5、CCDC88B、NUDT22、SCPEP1、KIF3C、WZSP016177、FAM151B和LBH等。Pokluhar等[40]通过比较松辽黑猪和长白猪的生产与肉质性状(包括脂肪和肌肉生长)间的差异，共检测到877个差异表达基因，包括LCN2、CES3、DGKB、OLR1、PGM1、PCK1、ACACB、FADS1、FADS2、MOGAT2、SREBF1，以及已知的对脂肪性状有显著影响的LEP和PPARGC1B等，并鉴定出1 071个具有相关性的lncRNAs，其中85个lncRNAs被差异表达，包括53个上调和32个下调。研究证实，miRNA和lncRNA参与机体的脂类代谢和脂肪生成通路[41-42]，二者可通过互作影响肌肉发育，如linc-MD1可分别与miR-135及miR-133特异性结合，进而保证这二者的靶基因，即肌细胞增强因子2C(MEF2C)及决定因子样蛋白1(MAML1)的表达[43]。

1.2 抗病相关基因

非洲猪瘟的暴发，使养猪业遭受到了严重的打击，对猪抗病相关的研究再次成为了热点，而在猪养殖过程中不仅存在非洲猪瘟病毒(ASFV)的影响，还有很多其他病原体如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪三角冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)等高致病率病毒与致死率的细菌(如猪链球菌(SS)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、猪副嗜血杆菌(GPS)等)同样影响着养猪业的发展。目前，已找到了很多与猪抗病相关的基因，参与病原体的感染或在感染过程中发挥重要的作用。

1.2.1CD163基因 CD163是位于单核巨噬细胞表面的一类富含半胱氨酸重复序列的跨膜蛋白，在细胞外具有9个清道夫受体半胱氨酸富集结构域(SRCR)[44]。CD163作为巨噬细胞表面受体能够与多种细菌的菌毛或细胞壁的脂多糖结合，研究发现，CD163与硫酸肝素(HS)和唾液酸黏蛋白(Sn)相似，均能够作为猪肺泡巨噬细胞(PAM)表面的受体参与PPRSV对机体的侵袭作用，且越来越多的研究证实CD163是PPRSV感染宿主细胞的关键受体，其SRCR5结构域作为病毒识别的核心结构域与PPRSV的感染直接相关[45]，敲除SRCR5 LBP区域可得到对PRRSV基因型2具有完全抗性的猪[46]。据报道，将CD163 SRCR5结构域替换为人CD163的SRCR8结构域后，基因编辑猪获得了PRRSV基因型1的抗性[47]。综上所述，CD163的缺失能够赋予猪对PRRSV的完全抵抗能力。

1.2.2 猪氨肽酶N 氨肽酶N(APN，又称为CD13)是一种胞外酶，猪氨肽酶N(pAPN)通过其N-末端与膜结合。研究发现，对新生仔猪致死率可达100%的TGEV在猪中会引起严重的肠炎、呕吐和水样腹泻等症状，其感染机制即通过其糖蛋白(S蛋白)与宿主细胞表面受体pAPN结合而进入宿主[48]。敲除猪pAPN基因后能够极大地降低TGEV的感染[49]。在易感细胞IPI-2I中，pAPN的缺失能够完全阻止TGEV的感染，且pAPN还参与了肠道致病性PDCoV的感染过程，PDCoV的可溶性S1蛋白同TGEV-S1一样能够与表达pAPN的目标猪细胞系表面发生有效结合，而通过可溶性的pAPN预处理能够阻断这种结合作用，且在非易感的细胞表面外源表达pAPN后赋予了PDCoV-S1的结合及PDCoV进入细胞的易感性[50]。除此之外，pAPN还对PEDV的增殖具有促进作用[51]。

1.2.3FUT1基因FUT1基因最初是在研究引起仔猪腹泻的病原体中一个最主要的致病菌——产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F18受体基因座的候选基因中分离得到的，是一种含有α(1,2)岩藻糖基转移酶的黏粒基因，该基因能够促进2种产肠毒素大肠杆菌(ETEC和VTEC)通过菌毛发挥作用[52]。Wang等[53]对中西方猪的FUT1基因进行PCR-RFLP分析发现，相比西方猪品种，中国地方猪品种缺乏对ECF18细菌产生抗性的基因型，且在自然感染PRRSV和副猪嗜血杆菌后，中国地方猪发病的风险相对更高。在欧洲野猪FUT1基因型中，法国野猪中的抗性等位基因仅以非常低的频率出现，该猪种也具有更高易感性[54]。 此外，FUT1不同基因型在维持猪肠道稳态中也具有一定的作用[55]。

1.2.4 猪白细胞抗原 白细胞抗原(SLA)是主要组织相容性复合体(MHC)在猪中的另一种名称，具有3种基因型，SLA-Ⅰ在不同品种猪间存在显著的遗传差异，而这种高度遗传多态性正是猪对传染性疾病、疫苗和移植后的免疫反应最重要的因素之一[56]。研究发现，猪SLA-Ⅰ类分子的表达与猪伪狂犬病病毒(PRV)感染引起的猪伪狂犬病(PR)有关，PRV可利用其pUS3及pUL56等蛋白通过溶酶体途径下调PK-15细胞中SLA-Ⅰ类分子重链(HC)的表达而产生免疫逃逸，进而导致PRV的持续性感染且难以被根除，对养猪业造成严重危害[57]。Yang等[58]利用PCR-SSCP对290头中国烟台黑猪仔猪进行检测发现，SLA-Ⅱ 2条链上的主要基因DQA和DRA外显子2的多态性与仔猪腹泻之间存在显著相关。在SLA-Ⅱ的基因簇中，SLA-DOB主要参与抗原递呈，并在PRV感染猪宿主细胞的功能调节中发挥作用，且SLA-DOB突变体和单倍型显著影响妊娠母猪的IgG和PRRSV特异性抗体水平[59]。SLA-Ⅲ位于靠近着丝粒区域，目前关于其在猪免疫力等方面的研究报道较少。

1.2.5 其他关键基因 除上述各大类基因外，还有很多基因与猪的各种疾病间存在重要的联系。刘晨曦等[60]对引起仔猪腹泻的致病菌研究发现，除FUT1基因外，MUC基因也可作为ETEC F4受体参与感染作用。ARFGAP1是COP Ⅰ系统相关蛋白的一员，COP Ⅰ的相关蛋白GBF1和ARF1参与了经典猪瘟病毒(CSFV)感染后在宿主细胞内的复制，且CSFV NS5A可以诱导宿主细胞发生内质网应激(ERS)，而ARFGAP1作为一种NS5A结合蛋白能够抑制CSFV NS5A诱导的ERS，表明其在介导CSFV感染细胞造成的细胞损伤中起重要作用[61-62]。研究表明，作为一种小型Rab GTPase的Rab18是CSFV RNA复制和病毒粒子组装所需的新型宿主因子，主要通过与病毒蛋白NS5A相互作用发挥其功能[63]。除各种通路相关的蛋白之外，细胞内的各种炎症反应因子如白细胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10)、干扰素(IFN-α、IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等也在免疫反应中发挥着重要作用，IL-10介导的免疫抑制被认为可能在猪圆环病毒2型(PCV2)感染和断奶后多系统消耗综合征(PMWS)的发展中发挥重要作用[64]。

1.3 繁殖性状相关基因

猪的繁殖性状包括很多，如产仔数、产活仔数、窝重及初产仔数、经产仔数等，目前已筛选到许多与猪繁殖性状相关的重要基因。

1.3.1 雌激素受体 雌激素受体(estrogen receptor，ESR)介导雌激素影响相关基因表达，从而调控哺乳动物的生长和繁殖机能。1996年，Rothschild等[65]首次提出ESR基因座的特定等位基因与窝产仔数增加有关，这也是首次发现的与猪产仔数密切相关的有效基因。研究发现，清平猪与大白猪杂交的F1和F2代黑猪群体ESR基因AB基因型个体的妊娠期更短[66]；嘉兴黑猪ESR2基因外显子1的A221G位点与总产仔数、产活仔数、死胎数等显著相关[67]；但在二花脸猪[68]、苏淮猪[69]、环江香猪等其他地方猪种中并未发现这种关联性[70]。

1.3.2 血清视黄醇结合蛋白 血清视黄醇结合蛋白(retinol-binding proteins，RBP)主要指RBP4，它是目前已证实的唯一一类可在血液中转运维生素A的蛋白，可以维持子宫内环境、调节卵泡和胚胎发育。研究发现，RBP4基因不同基因型能够显著影响猪总产仔数和产活仔数[71]，这与Tang等[72]利用EigenGWAS和Fst技术对3个典型商业猪品种(杜洛克猪、长白猪和约克夏猪)的测序数据相一致。王万兴等[73]采用PCR-HRM分析与PCR产物直接测序相结合的方法分析发现，RBP4基因G45A位点能够显著影响松辽黑猪产仔数。刘乙等[74]利用PCR-RFLP技术分析发现，RBP4基因显著影响大白猪总产仔数、产活仔数、健仔数及窝重性状。但目前关于RBP4的研究仍相对较少，已知的功能作用即通过在体内协助维生素A转运进而影响猪繁殖性能、胚胎生长发育和肉品质性状[75]。

1.3.3 骨桥蛋白 骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种磷酸化的糖蛋白。罗仍卓么等[76]对长白猪、大白猪和北京黑猪OPN基因多态性及其与繁殖性状的关联分析发现，OPN基因表现出AA、AB和BB 3种基因型，在长白猪中初产母猪AA基因型和经产母猪AB基因型个体的总产仔数和产活仔数显著高于AA、BB基因型；在大白猪中这种优势体现在BB和AB基因型个体中，且A和B等位基因分别为长白猪和大白猪的优势等位基因，这与马力鹏等[77]研究结果相同，这种单等位基因的优势同样分别体现在皮特兰猪和杜洛克猪中，但是这种现象在北京黑猪中并没有发现，其基因型全部为BB基因型，而在具有高繁殖力的小梅山猪中却只有AA和AB 2种基因型，且AA基因型占绝对优势[78]。OPN基因在公猪生殖细胞各阶段的表达量不同可能直接影响公猪受精力[79]。

1.3.4 催乳素受体 催乳素受体(prolactin receptor，PRLR)作为靶细胞上的受体传递催乳素(prolactin，PRL)信号，促进动物乳腺和性腺的发育。张淑君等[80]研究发现，PRLR基因与母猪窝产仔数有关，不同基因型能够显著影响大白猪、长白猪、梅山猪的总产仔数和产活仔数，其AA基因型个体的生殖器官相比BB基因型更大，且产仔数也显著高于BB基因型。刘庆雨等[81]对中国地方猪种PRLR基因多态性分析发现，AA基因型个体头胎产仔数和产活仔数均显著高于AB基因型，在松辽黑猪和长白猪中也发现AA基因型个体的断奶仔猪数、乳头数均显著高于AB和BB基因型；在初产松辽黑猪中AA基因型个体总产仔数、产活仔数及其他性状也具有显著优势。这种基因优势同样表现在圩猪、定远猪和保山猪中[82]，而在大白猪和长白猪中的优势等位基因为B，且大白猪BB基因型个体总产仔数显著高于AA基因型，长白猪BB基因型个体断奶仔猪窝重显著高于AB基因型[83]。

1.3.5 其他关键基因 目前，促卵泡素β亚基(FSHβ)基因、转化生长因子超家族主要成员之一的GDF9、BMP家族中骨形成蛋白(BMP7、BMP15)及其受体BMPR1B等均被发现在猪的繁殖性能中发挥着重要的作用，极大地影响着猪的生产效率[84]。除此之外，还有许多基因也被发现对猪的繁殖性能有着显著影响，如NCOA1、FUT1基因与猪总产仔数、总活仔数、健仔数和初生窝重等显著相关，且NCOA1和FUT1基因合并基因型中AAAA基因型经产母猪的繁殖性状显著优于AAAG和AAGG基因型[85-86]；定位在猪7号染色体上的视黄酸X受体β(RXRB)基因不仅与大白猪活体背膘厚、眼肌面积及初生重等性状呈极显著或显著相关，还与繁殖性状如乳头数间存在极显著相关[87]；作为核受体5A亚家族(又称FTZ-F1家族)成员之一，NR5A2基因多态性与松辽黑猪繁殖性状(总产仔数、产活仔数及断奶仔猪数等)相关[88]；与龋齿发育相关的基质金属蛋白酶-20(MMP20)、Wnt信号通路的负调控因子DKK(Dickkopf)蛋白家族成员之一的DKK2、促红细胞生成素产生肝细胞配体A1(ephrin A1)等也可能与猪繁殖性状相关，仍有待进一步研究。

2 育种价值基因挖掘技术

2.1 数量性状定位

猪的肉质、抗病和繁殖性状等几种重要的经济性状均为数量性状，且重要经济性状相关主效基因的寻找需先进行数量性状定位(QTL)。QTL往往是与遗传连锁图谱的构建同时进行的，主要方法有候选基因途径、基因组扫描法、比较基因组学及分子遗传标记[89]。候选基因途径主要是通过对转录组测序得到的差异表达基因进行研究，以确定其中的关键因子。基因组扫描法主要是利用研究物种已有的遗传连锁图谱对其染色体进行微卫星标记，再通过全基因组扫描获得其QTL进而得到与其表型相关的重要等位基因位点[90]。比较基因组学是基于基因组图谱和测序结果对基因及基因组结构进行比较，进而得到差异基因并了解相关基因功能。分子标记在以上众多方法中均有应用，如对候选基因进行筛选、利用微卫星标记进行基因组扫描及对特定基因进行遗传标记等。

2.2 分子标记技术与全基因组选择

在人类基因组计划及猪基因组计划的推动下，分子标记技术在实际研究中得以快速发展与广泛应用，按检测手段不同可分为4类：①基于分子杂交基础的分子标记(如限制性片段长度多态性(RFLP)技术、原位杂交(ISH)技术)；②基于简单重复序列(SSR)或短串联重复序列(STR)的分子标记；③基于PCR技术(如随机扩增多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)及插入/缺失多态性(InDel)检测)；④基于单核苷酸多态性(SNP)的分子标记[91]。近年来，基于SNP的分子标记技术的应用较为普遍，特别是随着新一代DNA测序技术及DNA芯片技术的发展，SNP检测技术也得到了进一步的完善，现已大量用于畜禽遗传育种研究，如将高通量测序获取的高密度SNP遗传标记应用于构建动物遗传图谱、将SNP用于具有复杂遗传机制的数量性状的标记辅助选择，以及利用GWAS鉴定具有复杂性状的主效基因[92]。这种利用覆盖整个基因组的高密度SNP计算个体的基因组估计育种值(GEBV)的全基因组选择法(GS)也成为了动物育种中的热门技术，其比常规育种的准确性更高，且这种方法已为很多公司和机构所采用，如DanBred、TOPIGS、PIC及国内的温氏集团等。也有研究利用引物竞争性PCR与高分辨熔解曲线(HRM)分析相结合的基因分型方法鉴定动物模型中的点突变，进而对疾病病理机制相关的候选基因进行筛选[93]，以及HRM结合实时荧光PCR法(HRM-qRT PCR)对致病菌进行检测分析[94]。在前述研究中即涉及到了众多相关的技术，如GWAS、PCR-HRM、PCR-RFLP、PCR-SSCP等。

2.3 基因编辑技术

在生命科学邻域广泛应用的基因编辑技术也随着人们对解释生命现象研究的逐渐深入得到了不断地发展，特别是进入21世纪后，从锌指核酸酶(ZFN)技术到转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)技术，再到现在刚获得诺贝尔奖的成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术，使得基因编辑技术的运用越来越简便，应用范围也越来越广泛，除了对已知的基因进行编辑以获得其编码功能与作用外，在重要性状但功能未知基因的筛选上也有了很多的应用[95]。其中CRISPR/Cas9系统以其构建突变体文库速度快，针对性强等优点脱颖而出，在基因组水平上的突变体及关键基因上的筛选得到了广泛的应用[96]。Wei等[97]通过全基因组CRISPR/Cas9文库筛选，确定了丝氨酸合成途径(SSP)中的第一个定型酶(磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH))是晚期肝细胞癌(HCC)标准治疗方法索拉菲尼(sorafenib)耐药性的关键因素，为肝癌的晚期治疗提供了新的方向，以及将基于CRISPR/Cas9技术的基因筛查手段用于识别对肿瘤生长和转移至关重要的功能缺失突变基因等在疾病治疗领域的应用[98]。在猪上，孙慧敏[99]利用基于CRISPR/Cas9技术的筛选平台对CSFV侵入机制中的关键蛋白进行筛选，成功得到了12个候选基因，且该平台还可以用于其他病毒的入侵机制关键作用蛋白及编码基因的筛选。

2.4 功能基因组筛选

随着基因组学的发展，各种测序技术也得到了快速的发展与应用，利用前期通过各种测序技术得到的大量基因组数据，研究人员开始对基因型和表型之间的关系进行大量研究，而其中最关键的是在基因组规模上进行分析[100]。目前已获得了大量通过系统性功能丧失进行全基因组正向筛选所需的遗传信息，且CRISPR-Cas9基因编辑技术的发现及其作为全基因组筛选工具的成功应用为全基因组功能丧失研究提供了方法[101-102]。在后基因组或功能基因组时代，利用这种功能丧失后给予各种条件处理，如利用病毒或细菌感染、改变生存环境、施加药物等，进而识别得到突出的具有某些抗性或敏感性的基因，这种功能基因组筛选可以突出某些基因对相关表型的影响，且能够解决细胞通路、疾病状态和药物靶标识别等的复杂性[103]。特别是将多种基因组进行联合分析，能够更加深入全面地分析数千个与复杂性状相关的基因位点，促进对复杂性状的理解[104]。这在动植物中都有了较多的应用，如将BSA和RNA-Seq技术结合，整合DNA和RNA组学成功缩小了候选基因的筛选范围，并高效锁定了目标基因[105]；将基因组与转录组即多组学结合进行分析，揭示了与疾病严重程度相关的性状的潜在遗传性，且提供了精准治疗的新靶点[106]；为了解决同一个体不同时间的差异变化问题将转录组、代谢组、脂质组、免疫细胞组及肠道微生物组进行结合检测分析，得到更为全面深入的数据[107]。在猪中，也有将代谢组学和转录组学综合分析以寻找其饲料效率的生物学途径[108]。而随着测序数据的不断丰富，越来越多新的基因组数据被发现，单一参考基因组已经无法满足科学研究对某一物种进行全面分析的要求，继而泛基因组——一个物种中所有的DNA序列的集合也得到了发展[109-110]。随着畜牧业的发展及对猪产业的重视，或许这些技术将会在猪的肉质、繁殖、抗病等优势性状及其关联的价值基因的功能作用研究中得到更多的应用。

3 展 望

在对上述重要经济性状相关基因总结时，发现当前多基因联合研究成为了许多学者关注的方向，如Xu等[110]通过对PRRSV和TGEV 2种高致病率病毒的已知受体进行双基因敲除(DKO)，成功获得对2种病毒均具有完全抗性的DKO猪，同时降低了另一种高致病性病毒PDCoV的易感性；李涛等[86]将NCOA1和FUT1的合并基因型与经产母猪的繁殖性状进行分析，这种将育种价值基因联合分析的方法可以充分利用它们之间的协同作用进而提高育种效率，且这种多基因联合分析的思路可能会在今后研究中得到广泛的应用与发展。目前，人们对于猪重要性状相关基因的研究从未间断，作者通过系统总结猪肉质、抗病及繁殖性状相关的重要育种价值基因及其挖掘技术，以期为猪的遗传改良提供指导性建议，以及为养猪业提高经济效益和遗传选育研究提供参考。