人口腔微生物多样性及功能分析

杨莉莉 李冬娟 丁盼

摘要：消化道从生理上划分，主要包括口腔、咽部、食道、胃和肠道，口腔微生物群可随吞咽动作进入胃肠道，有研究提示口腔微生物群—生态平衡紊乱将引起一系列口腔感染性疾病及一些全身性疾病，为探究人口腔微生物群的均匀性、多样性和组成，并预测菌群的功能变化。本文利用无菌拭子收集颊部黏膜样本置于口腔拭子DNA保存液中。采用特殊的测序技术对口腔微生物进行测序，并通过生物信息分析，描述口腔微生物结构和多样性。

关键词：口腔微生物;多样性;测序

引言：微生物群系是指在一个生态系统（如人体）中共存的所有微生物生命体，微生物群分布在人体的不同部位，有着重要的作用，对维持机体内环境稳态、人类健康有密切关系。口腔微生物群由数十亿种微生物组成，仅次于肠道菌群，口腔微生物群对口腔健康和炎症有促进作用，如因口腔菌群失调促进了Th17介导的牙周炎症。因此为保持口腔健康及全身健康，进行口腔微生物菌群多样性及功能性分析十分有必要。

一、口腔微生物多样性

口腔微生物组指包括细菌、古细菌、真菌、和病毒的微生物总和，因受年龄、环境、地区、饮食习惯等影响口腔微生物显示出一定的差异性，目前研究表明，口腔微生物的组成中，占主导地位的门为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和放线菌门;在属水平，占主导地位的属为普鲁士菌属、纳瑟氏菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属、链球菌属等。

1、口腔细菌多样性

口腔细菌中可鉴定出101个不同细菌属，硬杆菌、放线菌、链球菌属、螺旋杆菌较为常见。

收集健康的未患有口腔疾病且12h内未进行口腔清洁人群的唾液样本置于含等量裂解液的试管中，并提取DNA，设计引物来扩增微生物16S rRNA基因的一个片段并在核糖体数据库中进行序列比，利用序列生成系统发育树，随后确定种属。

2、口腔真菌属多样性

口腔中有74中可培养真菌属和11种不可培养真菌属，其中以曲霉属、念珠菌属、枝孢菌属和酵母菌属为主导

在饭后1h收集口腔样本，研究参与者用无菌磷酸盐缓冲盐水漱口，将口腔内容物吐于离心管中，离心后提取DNA进行PCR分析，选择能够检测真菌ITS1区域的引物，将标记荧光值进行电泳图转化，从而获得电泳图中每个峰的归一化丰度。真菌菌落分析采用多标记454焦磷酸测序技术，进而分析DNA序列。

3、口腔病毒组

相对细菌以及真菌而言，人体口腔中病毒的多样性并不丰富，已被认知的多以噬菌体、疱疹病毒为主，绝大多数口腔病毒还未属于未知种类。利用鸟枪测序在进行病毒数据库比对获取相关病毒的信息。

4、口腔古细菌组

在建康的人群和患有口腔疾病的人群中均可检测出古细菌，但目前研究表明这些古细菌不具有致病性，其中口腔甲烷杆菌、史氏甲烷短杆菌可被分离培养。

二、口腔微生物的功能性分析

口腔微生物与宿主之间，存在着一种微妙的平衡关系。当微生物与宿主之间处于平衡状态时，口腔中的微生物可作为第一道屏障，阻止外源性致病菌的入侵，其中免疫防护的功能;而当微生物与宿主间的平衡失调时，则会诱发多种口腔疾病，甚至会引起全身系统性疾病。

1、龋齿

龋齿属于细菌性疾病，它可继发牙髓炎和根尖周炎，甚至引起牙槽骨和颌骨炎症。龋齿的继发感染可以导致关节炎、心骨膜炎等全身其他疾病。

目前多数研究认为远远链球菌和变形链球菌在龋齿发生过程中具有重要作用，但分子生物学研究表明，在龋齿发生过程中，以乳酸菌、放线菌和双歧杆菌是优势菌种。在进行患有龋齿和健康人群的样本采集中，无龋齿的人群口腔微生物组构成稳定，而不同年龄段的龋齿患者的口腔微生物组变异较大，其中普雷沃氏菌属、韦荣球菌属丰度较高，表现出一定的生物学功能，研究表明部分口腔细菌可能是龋齿患者所缺失或被抑制的，这部分细菌的功能对于龋齿的发生具有重要意义，比如，在儿童患龋齿的患者中，表现出厚壁菌门减少、纳瑟氏菌属增加的特点，而在青年和成年组中，则表现出厚壁菌门增加、变形菌门、纳瑟氏菌属减少的特点，也说明部分菌株随着年龄的改变功能也在发生改变。

2、牙周炎

慢性牙周炎是由菌斑及其产物导致的慢性感染性疾病，通过比对慢性牙周炎患者和健康人群的口腔微生物，确定优势菌属，为慢性牙周炎的治疗以及预防提供理论支撑。在该疾病患者的样本中显示出螺旋体属、卡氏菌属、单胞菌属的高丰度，其中以革兰氏厌氧菌为主。同时能够引起牙周炎的菌属在其他疾病中有一定的致病性功能，比如牙龈炎、口腔癌及其他系统性疾病。

3、口臭

口臭是指口腔异味，通常是因口腔微生物分解物质而产生挥发性硫化物造成的，而引起口臭的微生物多存在于舌背。通过与健康人群对比，口臭患者口腔微生物表现出更高丰度，其中以韦德纤毛菌和口炎消化链球菌为代表，而健康人群则以唾液链球菌、真杆菌属为优势菌属。

4、口腔溃疡

口腔溃疡常被人们认为是上火的表现，但该病的诱发也与口腔微生物失调有关，表现出一定的周期复发性的特点，而口腔中的链球菌、纳瑟氏菌属以及革兰氏阴性菌的含量降低会使口腔溃疡的发作频率升高，而这些菌株是健康人群的优势菌株，这些菌属的降低，使得宿主与微生物的相互作用平衡遭到破坏，一些病原体入侵导致口腔疾病，这则体现出口腔微生物的屏障功能。

5、口腔鳞癌

口腔鳞癌被列为全球第八大常见恶性肿瘤，是指发生在口腔包括舌、牙龈、颊、颚等部位的鳞状上皮癌。在以往研究中，通产认为罹患这种疾病的原因主要是由于吸烟、饮食、病毒感染、紫外线辐射以及个体遗传，而在最新的研究中發现一些口腔微生物也与癌症的发生有密切联系。从口腔鳞癌组织中分离菌株并进行功能性测序，发现某些微生物只定植于肿瘤组织内，说明该菌株后续可作为肿瘤标志物进行研究，比如在癌组织中发现链球菌属、罗氏菌属显著减少，微小微单胞菌、梭杆菌属显著增加为特点。口腔微生物可通过抑制凋亡、激活细胞增殖通路、促进细胞侵袭从而诱导炎症进而引发癌症。

结束语：随着对口腔中的微生物的多样性研究以及功能预测的深入研究，为后续研究口腔疾病以及预防提供了思路，可进行检测疾病中的特定菌种，来进行菌种的抑制或扩大优势来减缓疾病，甚至作为全身性疾病的预警;在口腔微生物多样性和功能性的测定中，利用的16SrRNA和焦磷酸测序技术都是十分新颖的，可检测到许多在口腔微生物库中未被认知的菌种，而这些菌种是否具有功能，需要进一步的研究，而这对于丰富基因库和疾病预防具有重要意义。

参考文献：

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【课题项目】天乐酒厂酿造环境中微生物多样性及功能分析（课题编号：KJ2020A1146）

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