新型湿法纳米银制备技术及其毒性行为*

鲁曦泽，姜宇凡，李英华，郝嘉言，谭文宇，任晓宇

(东北大学 资源与土木工程学院， 沈阳 110000)

0 引 言

纳米银由于其独特的导电性、抑菌性、抗氧化性和表面活性高等优点备受社会关注，在催化材料、低温超导材料和家电医疗等领域拥有非常广阔的应用价值[1]。因此，探究纳米银粒子的制备与应用具有重要意义[2]。

目前，纳米银的合成方法很多，按原理的不同可分为物理合成法[3]、化学合成法[4]和生物合成法[5]。其中化学合成法在工业领域应用最为广泛，具有设备简单、操作方便和反应条件温和以及成本较低等优点[6]。鲁志强等采用液相化学还原法，以硼氢化钠为还原剂，硝酸银为前驱体，PVA(聚乙烯醇)为分散剂，制备出高纯度的纳米银粉[7]；魏春萍利用PVP作为分散剂，硼氢化钠为还原剂制备纳米银，同时对纳米银在不同分散介质下的稳定性进行了研究。研究发现，以硝酸银为银源制得的产品，存在高表面能导致的团聚沉降问题。而以[Ag(NH3)2]OH溶液为前驱体制备的纳米银胶体品质有较大改善[8]。随着纳米银被广泛应用的同时，其所带来的环境效应日益成为人们关注的焦点。纳米银产品的过量使用势必导致纳米银进入环境中，其自身存在的生物毒性对生态系统的结构、性质和功能产生一定的影响[9-10]。同样会影响天然水体中反硝化菌的生存与行为，扰乱生物脱氮过程，进而破坏自然界中的氮循环[11]。

针对纳米银制备过程中存在的问题，本研究以柠檬酸钠和乙醇为还原剂，[Ag(NH3)2]OH溶液为前驱体，柠檬酸钠和聚乙烯吡咯烷酮为保护剂，在水浴加热条件下制备得到纳米银溶液。进一步，以反硝化无色杆菌为模式菌株，探究所制备的纳米银对其毒性作用及机理。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

硝酸银、柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇、氨水均为分析纯国产试剂。反硝化无色杆菌Achromobacterdenitrificans购自北京北纳创联生物技术研究院(BNCC135026)。扩大培养基：营养肉汁培养基; 氨化培养基(g/L)：蛋白胨5，NaCl 0.25，KCl 0.3，K2HPO40.25，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，pH 7.0～7.5; 硝化培养基(g/L)：NH4SO40.47，C6H12O62.5，MgSO40.2，FeSO4·7H2O 0.01，CaCl20.02，K2HPO41，KH2PO41，pH 7.0～7.5。

JJ-1H数显恒速电动搅拌器(常州荣华仪器制造有限公司)；紫外-可见分光光度仪(UV-2501PC)；场发射扫描电子显微镜(ULTRA PLUS)；场发射透射电子显微镜(G20)；多晶X射线衍射仪(Pertpro)；Zeta电位仪(Zetasizer Nano S)。

1.2 纳米银制备

本研究用柠檬酸钠和乙醇按一定配比制成20 mL还原溶液，后加入定量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为保护剂。取20 mL一定浓度的银氨溶液置于三口烧瓶中，调整转速为450 r/min，水浴加热，随后逐滴加入还原溶液(2 mL/min)，反应一段时间后制得纳米银溶液。超声震荡后用无水乙醇洗涤3次得到纳米银胶体。

1.3 最佳制备条件的探究

研究发现，银氨浓度、反应底物摩尔比、反应温度和时间是影响纳米银制备的关键因素，利用单因素控制变量法探究各因素的最佳反应条件。

最佳反应时间的探究：将0.005 mol/L的硝酸银溶液配成银氨溶液，按一定底物摩尔比(n(柠檬酸钠)∶n(无水乙醇)∶n(硝酸银)=1∶15∶1)配制还原溶液，后加入一定质量分数为31.2%的PVP，搅拌均匀后按上述步骤进行反应，于不同时间点(60、75、90、105 min)采样。样品稀释一定倍数后用紫外-可见分光光度仪进行检测，分析比较紫外可见光吸收曲线，选择最佳反应时间。

其余反应条件的探究：改变无水乙醇：硝酸银的摩尔比为8∶1、10∶1、12∶1、 18∶1、20∶1；硝酸银浓度为0.001、0.003、0.008、0.010 mol/L；反应温度为80、85、90、95 ℃，按照上述实验步骤进行取样、检测。探究不同的反应底物摩尔比、银氨溶液浓度、反应温度和反应时间对纳米银的影响。

1.4 纳米银的表征

确定最佳反应条件后，将浓度为0.005 mol/L的AgNO3溶液制备的纳米银胶体样品置于离心机在11 000 r/min下离心，用无水乙醇洗涤数次，烘干得到纯净的纳米银粉末，随后将制备的样品分别利用XRD、SEM、TEM以及EDS分析、激光粒度分析和Zeta电位分析技术进行表征，从而判断纳米银产品的结构以及形貌特性。

1.5 纳米银对反硝化无色杆菌生长特征的影响

将细菌接种至基础培养基中，使得初始OD600为0.07，高温灭菌后加入AgNPs储备液,控制培养液中AgNPs浓度梯度为0、1、5、10、15、20 mg/L，37 ℃、150 r/min条件下摇床振荡培养,定期取样检测OD600,设置两个重复对照组。

1.6 纳米银对反硝化无色杆菌生理活性的影响

1.7 细胞膜完整性分析

1.7.1 LDH检测

乳酸脱氢酶(LDH)是一种细胞质酶，在细胞体内含量丰富，当胞膜破裂后释放在细胞体外，利用培养基中的LDH释放率检测暴露培养后细胞膜破裂情况。利用试剂盒(碧云天)检测LDH活性，具体操作详见说明书。

1.7.2 扫面电镜观察

细菌扫面电镜样品制备方法参照伍玲丽等[12]的方法：取适量经梯度浓度为0、2、6、10 mg/L的AgNPs暴露培养12 h后的细菌溶液，进行高速冷冻离心-2.5%戊二醛固定-乙醇梯度脱水-乙酸异戊酯替代等步骤，每个步骤进行前用PBS缓冲溶液将样品冲洗干净，40 ℃下干燥4～6 h，收集样品进行扫描电镜观察。

2 结果与讨论

2.1 最佳制备条件的探究

2.1.1 反应时间的影响

利用样品在波长300～700 nm范围的紫外共振吸收曲线探究反应时间对纳米银胶体的影响，结果如图1(a)所示，随着反应时间的增加，各曲线均在波长432 nm左右出现最大吸收峰，峰值位置未发生偏移，峰值随时间变化先增大后减小，在90 min达到最大，表明反应90 min时纳米银的产率达到最大。反应不同时间后曲线的半峰全宽无明显变化，表明粒径分布范围差异不大。因此综合以上因素，纳米银制备的最佳反应时间为90 min。

2.1.2 底物摩尔比的影响

关于硝酸银与乙醇反应底物摩尔比的探究实验，测量其紫外吸收曲线，结果如图1(b)所示。随着乙醇比例的增加，最大吸收峰位置出现先蓝移(左移)后红移(右移)的现象，表明纳米银粒径随乙醇浓度的增加先增大后减小，当硝酸银与乙醇浓度比为1∶15时，曲线在波长431 nm处出现最大吸收峰，小于其它曲对应的吸收峰位置，相较其他条件，该条件制备的纳米银胶体平均粒径较小。且该曲线半峰宽宽度小于其他曲线，说明该条件所得到的纳米银粒度分布较均匀。摩尔比为1∶10条件对应曲线的吸光度为3.447，高于摩尔比为1∶15对应曲线的吸光度(3.32)，说明摩尔比1∶10对应的条件下纳米银浓度高、产率大，但是该条件对应曲线的半峰宽较宽，特征吸收峰位置也较大(440 nm)。综合考虑，选择最佳摩尔比为1∶15。

2.1.3 硝酸银浓度的影响

不同硝酸银浓度所对应的紫外吸收曲线如图1(c)所示。对比发现，随着硝酸银浓度增加，从左至右，纳米银最大吸收峰均出现红移现象，这说明不同浓度的前驱体制备出的纳米银胶体的粒径亦不相同。即随着前驱体浓度增加，纳米银胶体粒径增加。此外，由0.001和0.01 mol/L所对应的曲线高度以及半峰宽可知，过低和过高的硝酸银浓度均会导致生成的纳米银胶体易存在粒度分布不均、浓度较低等问题。在该浓度范围内，相较于其他曲线，硝酸银浓度为0.005 mol/L对应的分光曲线峰值最大、半峰宽最窄且吸收峰位置最小，因此选择硝酸银最佳反应浓度为0.005 mol/L。

2.1.4 反应温度的影响

图1(d)为不同温度条件下纳米银紫外吸收曲线。随着温度的升高，最大吸收峰出现蓝移现象，这表明：温度越高，所制备的纳米银胶体粒径越小；且随着温度逐渐上升，对应吸收曲线的半峰宽逐渐变窄、峰值亦逐渐变大，表明：温度越高，纳米银胶体粒度分布越均匀、纳米银浓度也越大。因此选择最佳反应温度为100 ℃。

图1 不同条件下的紫外曲线Fig 1 UV curves at different preparation condition

2.2 纳米银的表征分析

2.2.1 X射线衍射(XRD)分析

图2为经过上述较优条件制得的纳米银X射线衍射(XRD)谱。

图2 纳米银X射线衍射谱图Fig 2 X-ray diffraction XRD spectrum of nano-silver

从图2中可以看出，样品的特征衍射峰二倍衍射角2θ值依次为38.114°，44.298°，64.441°，77.395 °和81.538 °,分别对应于标准晶态银卡片Silver 3C-Ag(87-0597)的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)衍射峰，无其他杂质峰存在，说明用该方法制得的纳米银颗粒是高纯度的单质银。利用Scherrer公式计算纳米银粒子平均粒径，如式(1)所示[13]，

D=Rλ/βcosθ

(1)

式中：D为粒子直径，nm；R为Scherrer常数，0.89；λ为入射X射线波长，nm；θ为衍射角，(°)；β为衍射峰的半峰宽，rad。

经过计算，得单质银平均粒径约为49.3 nm。

2.2.2 纳米银胶体的形貌分析

将最佳制备条件下制得的纳米银胶体置于离心机在11 000 r/min下离心，用无水乙醇洗涤3次，得到纯净的纳米银溶液。将其烘干、制样后利用SEM进行观察，结果如图3所示。

SEM图中观察可知，制得的银纳米颗粒近似呈球形，粒径主要分布在50～60 nm之间，且样品粒度分布较均匀，形貌大小易控制，在可考虑误差范围内，与上述X射线衍射(XRD)分析结果近似一致。取少量上述纯净纳米银溶液并分散在铜网附有碳膜支持的一面。将铜网烘干后，进行TEM分析表征，结果如图4所示。

图3 纳米银扫描电镜图Fig 3 Nano-silver scanning electron microscope spectrum

图4 纳米银透射电镜图Fig 4 TEM image of nano-silver

由图4结果可见，纳米银颗粒近似为球形，粒径主要分布在50～60 nm处，且粒度分布依旧较为均匀，与上述SEM及XRD结果差别不大。

2.2.3 激光粒度分析和Zeta电位分析

图5、6分别为银纳米颗粒的激光粒度分析及Zeta电位分析图。粒度分析显示银纳米颗粒的流体动力学直径为68.27 nm，略大于透射电镜表征得到的平均粒径。Zeta电位分析显示其平均Zeta电位为27.8 mV，电位标准差为37.8 mV，体系存在较高电位。在1940年代Dergajaguin等提出了描述胶体稳定的理论[14-15]：胶体体系的稳定性是当颗粒相互接近时它们之间的双电层互斥力与范德瓦尔互吸力的净结果；当颗粒接近时颗粒之间的能量障碍来自于互斥力，当颗粒有足够的能量克服此障碍时，互吸力将使颗粒进一步接近并不可逆的粘在一起。因此Zeta电位则可以成为判定胶体稳定性的指示，即：Zeta电位愈高，颗粒间的排斥作用就愈强，颗粒的分散体系愈稳定。孙红刚等利用次磷酸钠为还原剂制得纳米银粉末，检测其在纯水中的Zeta<10 mV[16]。Yin等利用柠檬酸钠为还原剂和保护剂制得球形纳米银，在纯水中的Zeta电位为13.4 mV[17]。分析可知，本研究所制得的纳米银分散体系的稳定性较强。

2.3 纳米银对细菌生长特征的影响

不同浓度AgNPs暴露培养后细菌生长状况如下图7所示。

图5 纳米银激光粒度分析图Fig 5 Particle size analysis of nano-silver laser

图6 Zeta电位分布图Fig 6 Zeta potential distribution diagram

图7 不同浓度AgNPs培养后细菌生长曲线Fig 7 Bacterial growth curves after culture with different concentrations of AgNPs

观察可知，随着AgNPs浓度的增加，细菌对数期的增长速率逐渐降低，进入稳定期后的细菌数量也逐渐减少，表明细菌的生长速率与AgNPs浓度负相关。空白组与AgNPs浓度为1 mg/L的投加系统相比，生长趋势接近，培养时间超过8 h后进入快速增值期，24 h后进入稳定期。当AgNPs投加浓度为5 mg/L时，增殖期内细菌生长速率与空白组相比明显降低。AgNPs投加浓度为20 mg/L时，整个48 h培育期内，细菌数量无明显增加，该浓度下的细菌基本丧失生长活性。

2.4 纳米银对细菌生理活性的影响

图8 两种培养条件下纳米银对细菌氮转化能力的影响Fig 8 The effect of nano-silver on the nitrogen conversion ability of bacteria under two culture conditions

部分学者研究认为，粒径处于5～10 nm范围的纳米银可通过胞吞作用进入细胞，释放出Ag+，导致胞内氧自由基产生累积，线粒体膜通透性发生改变，从而破坏细胞代谢平衡[18-19]。本研究中在此浓度范围的纳米银可直接穿过细胞膜，抑制细菌的氮转化过程，并且随着纳米银投加浓度的增加，释放出的Ag+浓度随之增多，而环境中的有机质可将Ag+还原为Ag[20]，零价状态的Ag互相聚集，导致溶液中小颗粒的纳米银数量增加，对细菌的代谢抑制作用增强，氨化培养基中纳米银的毒性作用强于硝化培养基中的毒性作用。

2.5 纳米银对细胞膜完整性的影响

2.5.1 扫描电镜分析

利用SEM观察不同剂量纳米银(0、5、10、20 mg/L)暴露培养下细菌表面形态及结构变化，结果如图9所示；

观察图9可知，细菌表面光滑，结构饱满，此时的细菌正处于对数期，代谢旺盛，基本未出现破碎的细胞膜。图9(b)-(d)显示纳米银的投加导致细菌产生褶皱，膜表面出现大小不均的孔洞和塌陷部位，并且随着浓度的提高，不规则形态的细菌数量增多，部分细菌细胞膜完全破裂。Liu等研究发现纳米银可粘附在细胞膜表面，与膜表面的含硫蛋白相结合，造成胞膜破裂，出现“坑洞”，胞内物质泄漏，本研究中发现的结果与之相一致。

图9 不同浓度纳米银暴露培养后细菌扫描电镜Fig 9 Scanning electron micrograph of bacteria under varying concentration of nanosilver exposure

2.5.2 乳酸脱氢酶分析

利用乳酸脱氢酶(LDH)的研究可分析细胞膜完整性，检测空白组培养基中LDH的释放量为0.047 U/L，假设空白组中纳米银的释放率为100%，则暴露培养后培养基中的释放情况如下图10所示；

图10 纳米银对细菌LDH释放的影响Fig 10 The effect of nano silver on the release of bacterial LDH

观察图10可以看出，随着AgNPs投加浓度的提高，LDH释放率随之增加，对细胞膜的破坏作用愈加显著。当AgNPs投加浓度为1 mg/L时，LDH释放率为109%，与空白组对比无明显差异，表明对细胞膜无明显作用，该浓度下的细菌生长状态与空白组相比无太大差距。当AgNPs投加浓度为10和20 mg/L时，LDH释放率分别为175%和323%，都较空白组显著增多，表明在此培养条件下，细胞膜受到明显破坏作用，结合扫描电镜结果分析可知，AgNPs可接触细胞表面，破坏表层结构，导致细胞膜破裂出现“坑洞”。

LDH释放的研究验证了AgNPs对细胞膜的破坏情况，随着AgNPs投加浓度的增加，细胞膜的表面不再光滑，出现褶皱，部分细胞膜破裂，完整性遭到破坏，胞内物质流出。

3 结 论

(1)以银氨溶液为前驱体，柠檬酸钠和无水乙醇为还原剂，PVP与柠檬酸钠为保护剂，在一定反应条件下成功制得纳米银，利用单因素分析法对影响纳米银制备的反应时间、底物摩尔比、硝酸银浓度、反应温度等条件进行探究，结果表明其最佳制备条件为：反应时间90 min、硝酸银与无水乙醇的摩尔比1∶15、硝酸银浓度0.005 mol/L、反应温度100 ℃。在此条件下纳米银的紫外吸收曲线峰值位于420 nm左右，半峰全宽最窄，峰值较高，表明纳米银粒径分布范围小，产率高。

(2)利用SEM、TEM、激光粒度分析结果表明所制得的纳米银为球形颗粒，粒径处于50～60 nm范围，分布均匀，与紫外吸收曲线结果相符。Zeta电位为27.8 mV，XRD显示其晶格为面心立方结构。

(3)AgNPs可影响Achromobacterdenitrificans的生长以及氮降解能力，并且随着AgNPs浓度的增加抑制作用越强。当投加浓度达1 mg/L时，AgNPs对细菌的生长和氮转化能力与空白组相比差异不大，当投加浓度达20 mg/L时，细菌基本无生长，氮转化能力明显减弱。

(4)SEM以及LDH释放分析结果表明，培养基中的AgNPs可附着在细胞表面，破坏胞膜表面结构，导致表层膜发生破裂，胞内物质泄漏。纳米银对Achromobacterdenitrificans的毒性源于两个方面，一方面小颗粒纳米银可直接进入细菌体内，导致细菌代谢紊乱，生理活动受损；另一方面纳米银可直接附着于细胞表面，导致细胞表层结构受到损害，胞膜破裂。