芥菜型油菜野生及其衍生种质遗传多样性分析

赵海菲，杨秀玲，余坤江，王天娅，晏伟，Aimal Nawaz Khattak，田恩堂*

（1.贵州大学农学院，贵州 大学，贵州 贵阳，550025；2.贵州省思南县板桥镇农业服务中心，贵州 铜仁，565100）

芥菜型油菜（Brassica juncea，AABB，2n=36）是重要的异源四倍体油料作物和蔬菜，起源于白菜（B. rapa，AA，2n= 20）与黑芥（B. nigra，BB，2n =16）种间杂交后的染色体自然加倍。相比于甘蓝型油菜，芥菜型油菜具有更优良的抗旱[1]、抗病[2]和抗裂角等特性[3,4]。芥菜型油菜属于常异花授粉植物，异交率达到5%～30%[5]，而其异花授粉特性及其漫长的演化历史，使得该作物衍生出丰富的遗传类型，根据其用途可分为：油用、叶用、根用等[6,7]。传统的油菜类型主要根据表型及用途进行分类[8]，而分子标记则为传统分类提供了有力工具，如Wu 等利用161 个SRAP 多态性标记检测了95 份芥菜型油菜材料的遗传多样性，并根据结果将其明确分为三类：菜用芥菜、春性芥菜和冬性芥菜[9]。虽然传统的表型分类结果有时候与分子标记检测结果不一致[10]，但分子标记技术仍以其检测的客观、准确和快速深受分类学家及育种家青睐，也是对传统分类体系的有益补充。

种质资源对于任何作物的育种都是十分重要的，因为种质资源往往集中在少数国家和地区，且许多种质资源都濒临灭绝[11]。虽然中国是芥菜型油菜的起源中心之一，种质资源丰富，但在芥菜型油菜重新合成[12]及杂交选育[13～15]方向的研究略有滞后。在现有种质资源基础上进行拓宽，对于芥菜型油菜优异种质资源的挖掘、新品种选育及基础研究具有较大意义。为此我们前期搜集了大量的芥菜型油菜种质，并从中选出了34份野生芥菜型油菜微核心种质群体（micro-core population），前期品质分析和表型分析表明这些材料具有较大的遗传变异[16,17]。本研究在前期工作的基础上，通过34 份不同芥菜型油菜野生种质材料间的杂交及后代选育方法，创制大量芥菜型油菜的衍生种质材料。并利用ILP（intron length polymorphism，内含子长度多态性）标记技术对野生及其衍生种质的遗传多样性进行分析。而ILP 作为新一代的分子标记，具有较强的多态性、特异性、共显性和可靠性，先后在白菜和甘蓝型油菜[18]，拟南芥[19]、谷子[20]、稻谷[21]、玉米[22]、大豆[23]等主要作物的遗传多样性分析方面都有应用。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究选用34 份芥菜型油菜微核心野生种质为材料（表1），材料间表型差异较大[16]。通过这34份野生种质材料间的杂交和自交创建了一批芥菜型油菜衍生种质材料，创制方法为：等量混合34 份芥菜型油菜材料的花粉，并用毛笔将混合花粉授粉到每份材料的3 个去雄花蕾上去，从而获得了102个（3×34）杂交系。第二季，再用34个亲本的混合花粉对这102 个品系各自的2 个去雄的花蕾进行授粉，获得了204（2×102）个杂交系。最后，通过单籽传法将204 个杂交系自交到F5，并通过田间表型和分子标记筛选的方法，从中选取了51 份育种材料。全部材料种植在贵州大学教学实习场，并采集每份材料的幼嫩叶片用于DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 ILP 标记 利用改良的CTAB 方法提取85份芥菜型油菜材料的基因组DNA[24,25]。然后利用262对ILP引物[26,27]检测这些材料的基因型，其中102对引物来自拟南芥，160 对引物来自甘蓝型油菜。每个PCR（20 μL）反应体系包含1×标准PCR 缓冲液（NEB），1 U Taq 聚合酶（NEB），0.25 μmol/L 正向引物，0.25 μmol/L 反向引物，每个100 μmol/L dNTP 和50 ng 基因组DNA，总体积为20 μL。PCR 扩增包括在94℃初始变性5 min，35 个循环包括94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min；72℃7 min。所有PCR 产物均在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。凝胶通过溴化乙锭染色可视化，在数字凝胶成像系统（UV SOLO,德国耶拿）上拍照，并将标记信息录入电脑。

1.2.2 数据处理 收集并鉴定有关PCR 产物的详细信息。将多态性带评分为存在（1）或不存在（0），并输入数据库。通过SM 系数计算品系之间的遗传相似性，SM=（a+d）/（b+c），其中a表示品系i和j之间共有条带，b 表示品系i 特有条带，c 表示品系j 表示特有条带，d 表示品系i 和j 表示共同缺失条带。通过软件NYSYS-pc2.1（Rohlf 2000）使用UPGM 方法对相似性矩阵进行聚类分析（树状图）。

多样性指数（DI）是根据每个品系中某个位点的等位基因数来计算的，用于评估不同品系或群体的遗传多样性。

其中pi表示存在（1）片段数与总片段数之间的比值，ai表示不存在（0）片段数与总片段数之间的比值，i表示条带数。

1.2.3 含油量和蛋白质含量测定 含油量和蛋白质含量主要采用近红外法（福斯新一代NIRS DS 2500F 近红外多功能品质快速分析仪）测定。每份材料选取3 g 左右的饱满种子，并重复测定2 次，取平均值作为最终数据用于分析，结果以“%”表示。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

本文选用85份芥菜型油菜资源为研究材料，其中包含34 份微核心野生种质材料及其衍生的51 份种质材料。34 份野生种质中，有22 份油用芥菜；有12 份菜用芥菜（表1）。就种子颜色而言，23 份材料（67.6%）为栗色，7 份材料（20.6%）为黑色，3 份材料（8.8%）是黄色，1 份材料是灰黄色（表1）。这51份衍生种质均来自于34 份野生种质间混合授粉以及后续的自交和选择。利用262 对ILP 引物检测了85份材料的基因型，共获得305个多态性标记，其中大多数引物（224 对，占85.5%）仅产生一条多态性条带，34 对引物（13.0%）产生了两条多态性条带，2对引物（引物名称：At3g52990 和PIP1848）产生3 条多态性条带，而PIPR68 和At1g72890 分别产生了4条与5条多态性条带。

表1 34份芥菜型油菜野生种质材料Table 1 34 B.juncea accessions used in this study

2.2 聚类分析

利用305 个ILP 多态性标记计算出85 份材料遗传相似系数，结果显示遗传相似系数（GSC）在0.250（OP256-OP332）到0.990（OP3-OP12）之间不等，并使用NTSYS-PC 2.1 软件的UPGMA 方法构建聚类图（图1）。由图1 可知，树状图显示在GSC 值为0.496处可划分为两个类群。第Ⅰ类群包含42份材料（49.4%），分别包括18 份野生种质和24 份衍生种质材料，其中18 份野生种质材料又包括10 份油用和8 份菜用材料，GSC 平均值为0.510，范围在0.260 到0.990 之间。第Ⅱ类群包括43 份材料（50.6%），分别包括16 份野生种质和27 份衍生种质，其中16份野生种质材料又包括4份油用及12份菜用材料，GSC 平均值为0.520，范围在0.250 到0.990 之间。野生种质及其衍生种质以混合的方式聚集在一起，表明这些衍生种质亲本来源的广泛性。

图1 85份芥菜型油菜野生株系（W）和衍生株系（OP）的聚类分析Fig.1 Dendrogram of 85 lines in B.juncea parental lines（W）and the derivative lines（OP）

2.3 多样性指数分析

为了评估野生种质及其衍生种质间的差异性，引入了多样性指数DI。由图2可知野生种质及其衍生种质两组间的总体分布频率相似，这些品系的大多数DI 值集中在0.48 至0.50 之间。衍生种质DI值在0.34 到0.50 之间不等，平均值为0.48，野生种质亲本品系DI 值在0.39～0.50 之间，平均值为0.47，相比之下，衍生种质的DI值略高于亲本系。

图2 34份野生种质和51份衍生种质新品系的多样性指数（DI）分布Fig.2 Frequency distribution of the diversity index（DI）for 34 parental wild lines and 51 derivative lines

2.4 含油量和蛋白质含量变异分析

野生及衍生种质材料的含油量和蛋白质含量表现出了丰富的遗传变异，由表2可知，野生种质含油量分布在29.95%～42.47%之间，平均含油量为36.74%；蛋白质含量范围分布在16.04%～24.09%之间，平均含量为19.92%。衍生种质含油量分布在32.26%～46.25%之间，平均含油量为41.12%；蛋白质含量范围分布在21.93%～32.63%之间，平均含量为26.96%。衍生材料中，含油量前三的材料是：OP340（46.25%），OP45（45.92%）和OP356（45.40%）；蛋白质含量最高的材料是：OP224（32.63%），OP182（32.14%）和OP74（32.00%）。对野生及其衍生种质材料的种子含油量及蛋白质含量分别进行相关性分析，结果表明二者含油量与蛋白质含量之间均呈现极显著负相关关系，相关系数分别为-0.612与-0.899。

表2 野生及衍生种质材料含油量与蛋白质含量统计表Table 2 Information of oil and protein contents in parental wild lines and their derived lines

3 讨论与结论

基于外显子区域构建的ILP 型标记具有较强的重复性、可靠性及多态性，该类型的标记也是首次用于芥菜型油菜的遗传多样性分析。本研究利用多态性的ILP 标记将85 份种质材料划分成两个群体，每个群体内野生种质和衍生种质混合分布，说明新创种质与其亲本材料来源的亲缘关系。而新创种质具有更大的遗传变异范围，也为利用混合授粉方法拓宽芥菜型油菜种质基础提供了证据。此外，聚类结果可以为这些种质材料未来的杂交及新品种选育和基础研究提供重要的遗传信息。例如，我们课题组根据本研究中获得的芥菜型油菜种质“贵定苦油菜”和“余丰榨菜”之间具有较大遗传差异的特点（GSC=0.44），构建了一个芥菜型油菜重组自交系群体，该群体的后代表现出了较大的表型变异。同时，我们也发现9 种蔬菜型芥菜和25 种油籽芥菜并未按照传统分类聚入两个群体中，而是混合聚在一起，说明按照传统的应用分类与遗传聚类的分类可能存在不一致性。芥菜型油菜传统分类更多的是考虑材料的实际用途，而非考虑遗传差异，因此在传统分类和基于分子标记的遗传分类二者之间可能会出现差异,如Fu 等也曾报道了传统分类与基于芥菜型油菜的分子标记的遗传差异之间结果的不一致性[8]。

混合授粉法是近些年多亲本材料选育方法的延伸，本研究通过两轮混合授粉及后代选育方法，选出了51份性状较好的育种株系，这些材料在含油量和蛋白质含量上表现出了优于亲本的特性。衍生种质含油量和蛋白质含量的提升，主要是因为其聚合了多个亲本的优异等位基因，如中国农业科学院油料作物研究所通过聚合多个含油量优异等位基因选育出超过60%含油量的甘蓝型油菜新品系。野生及其衍生种质分别进行相关性分析显示，含油量和蛋白质含量均呈现极显著负相关关系，这点与前期研究结果一致[28]。目前，我国正在大力开展种质资源的搜集、保护与利用工作，尤其对于那些濒危野生资源意义重大。而本研究的开展则着眼于有限种质资源的利用，即可以通过种质资源间杂交结合表型筛选的途径获得优异新资源。本研究的开展对于芥菜型油菜育种与基础研究具有一定参考价值。