RP-HPLC-ELSD同时测定滇女金丸中5个皂苷类成分的含量△

仲侃，张紫佳*，饶正云，冯宝文，王朝军

1.上海中医药大学 中药研究所，上海 201203；

2.红云制药（昆明）有限公司，云南 昆明 650033

滇女金丸是由熟三七、香附（醋）、炙黄芪、酒续断等36 味中药制成的丸剂，具有补肾止血、调经止带的功效，临床主要用于由肾亏血虚引起的月经不调、带下量多、腰腿酸软、小腹疼痛等。目前，滇女金丸的质量标准中仅以芍药苷为含量测定指标成分。该方成分复杂多样，单一指标难以有效控制制剂质量，因此，需对其质量控制方法进行提升。酒续断在滇女金丸方中为君药，熟三七、炙黄芪为臣药。酒续断具有补肝肾、止崩漏的功效，其中的川续断皂苷Ⅵ含量较高，具有抗骨质疏松等作用[1-3]；三七能够化瘀止血、活血定痛，熟三七中的皂苷类成分具有活血化瘀、通脉活络的作用[4-8]；黄芪甲苷为黄芪的指标成分之一，在方中可起到补气健脾、培土治水以治其本的功效[9-11]。由此可见，皂苷类成分为酒续断、熟三七、炙黄芪三者的主要活性成分。为了更好地控制滇女金丸的质量，本实验选择三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ和黄芪甲苷为指标成分，建立了同时测定滇女金丸中这5 个成分含量的反相高效液相-蒸发光散射检测法（RP-HPLC-ELSD）。该方法稳定可靠，为更好地提升滇女金丸的质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260Ⅱ型系列高效液相色谱仪、1200 型系列高效液相色谱仪、色谱工作站（安捷伦科技有限公司）；BSA124S-CW 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］、KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品三七皂苷R1（批号：110745-201619，纯度：90.4%）、人参皂苷Rg1（批号：110703-201832，纯度：94.0%）、人参皂苷Rb1（批号：110704-201625，纯度：94.3%）、川续断皂苷Ⅵ（批号：111685-201707，纯度：94.3%）、黄芪甲苷（批号：110781-201492，纯度：95.2%）均购于中国食品药品检定研究院；滇女金丸为市售（昆明生达制药有限公司，批号：180609）；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

AgilentZORBAXSB-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～20 min，20%A；20～30 min，20%～21%A；30～35 min，21%～31%A；35～50 min，31%A；50～58 min，31%～40%A）；流速为1 mL·min-1；柱温为25 ℃；载气为氮气；体积流量为1.6 L·min-1；漂移管温度为50 ℃；增益5.0；进样量为10 μL；理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于7000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷10.92、12.77、13.87、30.64、11.47 mg 分别置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别制成质量浓度为1.092、1.277、1.387、3.064、1.147 mg·mL-1的对照品储备液。取上述对照品储备液适量，加甲醇制成质量浓度分别为三七皂苷R10.1 mg·mL-1，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb10.3 mg·mL-1，川续断皂苷Ⅵ0.5 mg·mL-1，黄芪甲苷0.1 mg·mL-1的混合对照品溶液，供定量测定使用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取滇女金丸适量，研细，过三号筛，取约4.0 g，精密称定，精密量取甲醇100 mL，冷浸过夜，超声（750 W，40 kHz）提取2 h，放冷，滤过，滤液浓缩至干，少量多次加入水13 mL 溶解，水饱和正丁醇振摇萃取3 次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性供试溶液的制备 按处方比例分别配制不含三七、续断、黄芪的阴性样品，按2.2.2 项下方法进行操作，分别制成熟三七、酒续断、炙黄芪的阴性供试溶液。

2.2.4 阴性对照试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试溶液、空白溶剂按，2.1 项下的色谱条件进样，记录色谱图，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷与相邻成分达基线分离，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 滇女金丸专属性考察色谱图

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取上述对照品储备液适量，置于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配置成含三七皂苷R10.087、0.109、0.237、0.546、1.092 mg·mL-1，人参皂苷Rg10.126、0.253、0.451、0.789、1.011 mg·mL-1，人参皂苷Rb10.063、0.125、0.251、0.502、1.003 mg·mL-1，川续断皂苷Ⅵ0.065、0.131、0.522、0.783、1.357 mg·mL-1，黄芪甲苷0.102、0.204、0.326、0.407、1.018 mg·mL-1的对照品溶液。按2.1 项下色谱条件分别进样10、20 μL，记录色谱图，以峰面积为纵坐标（Y），进样质量为横坐标（X），以外标两点对数法进行线性回归。得三七皂苷R1回归方程：Y=1.875 5X+1.920 8（r=0.999 7）；人参皂苷Rg1回归方程：Y=1.868 5X+1.909 0（r=0.999 6）；人参皂苷Rb1回归方程：Y=1.789 8X+2.167 7（r=0.999 9）；川续断皂苷Ⅵ回归方程：Y=1.8296X+2.2751（r=0.9997）；黄芪甲苷回归方程：Y=1.8130X+2.1128（r=0.9998）。结果表明三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷分别在0.087～1.092、0.126～1.011、0.063～1.003、0.065～1.357、0.102～1.018 mg·mL-1呈良好线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件每天进样6针，共进样3 d，以峰面积分别计算日内精密度及日间精密度。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷的日内精密度分别为1.40%、0.38%、2.18%、1.39%、1.69%，日间精密度分别为1.54%、1.32%、2.96%、2.76%、3.59%。结果表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取2.2.2 项下滇女金丸供试品溶液，分别在0、4、8、10、12、24、48、72 h进样，记录色谱峰面积，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷的RSD 分别为3.37%、2.04%、2.38%、1.86%、1.85%。结果表明样品在72 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 取同一批滇女金丸（批号：190401），按照2.2.2 项下方法进行操作，平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，计算含量，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷的RSD 分别为1.88%、2.35%、3.02%、1.67%、1.84%。结果表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的滇女金丸样品（批号：190401）2.0 g，精密称定9份，每3份加入相同量（分别为已知含量的50%、100%、150%）的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷对照品，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进行测定，以外标两点对数法计算含量、回收率、RSD（表1）。均符合《中华人民共和国药典》2020 年版（四部）的相关规定。

表1 滇女金丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ及黄芪甲苷的加样回收率试验

2.2.10 样品测定 取3批样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以外标两点对数法计算含量，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷平均质量分数分别为0.123、0.541、0.437、1.427、0.135 mg·g-1，RSD＜4%，含量差异较小，均一度较高。结果见表2。

3 讨论

3.1 提取条件考察

本实验对熟三七、酒续断、炙黄芪的提取条件进行考察，发现冷浸过夜后的效果明显优于未冷浸过夜的样品；通过对75%甲醇、甲醇、无水乙醇3种提取溶剂进行考察，发现甲醇的提取效率显著高于其他溶剂；进一步试验，以甲醇为提取溶剂，考察超声提取（750 W，40 kHz）、索氏提取、回流提取等不同提取方法，发现超声提取与索氏提取的提取效率相等，因此，选择超声提取；在提取溶剂体积、提取时间及提取次数方面，发现提取溶剂体积1∶25、提取2 h 和提取1 次最佳；鉴于经过水饱和正丁醇萃取和氨试液处理后的色谱图干扰峰明显减少，本实验考察了萃取溶剂体积及萃取次数，结果表明，萃取3 次，每次40 mL 可萃取完全。因此，本实验选择甲醇作为提取溶剂，冷浸过夜，超声（750 W，40 kHz）2 h，水饱和正丁醇萃取3 次，每次40 mL以制备供试品溶液。

3.2 检测器选择

本实验以熟三七、酒续断、炙黄芪中的皂苷成分作为检测对象，紫外检测波长均为末端吸收，基线干扰大，且黄芪甲苷在紫外检测下响应小[12-14]，而在ELSD 下各个待测组分均显示出了良好的响应值，且基线干扰小，因此，选用ELSD进行检测。

3.3 系统适用性考察

通过检测限与定量限试验，得出三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、川续断皂苷Ⅵ、黄芪甲苷检测限分别为0.448、0.498、0.298、0.230、0.350 μg；定量限分别为0.897、0.996、0.596、0.460、0.700 μg，且RSD均小于3%。

本实验还对流速、柱温及不同品牌的色谱柱进行了考察，发现该方法在流速分别为0.9、1.0、1.1 mL·min-1时均有良好的适应性，且RSD＜3%；在柱温为20、25、30 ℃时差异无统计学意义，RSD＜3%；通过对3 根不同品牌的色谱柱［Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Fortis Xi C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil®C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）］考察后发现其RSD＜5%，方法具有良好的适用性。

3.4 皂苷类成分的含量限度

按《中华人民共和国药典》2020 年版（一部）中熟三七、酒续断和炙黄芪的含量测定限度规定计算滇女金丸中相应成分的含量，因滇女金丸为全粉入药，根据药材限度下浮10%计算，滇女金丸每1 g含熟三七以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1的总含量计，应不得少于0.86 mg；含酒续断以川续断皂苷Ⅵ计，不得少于0.29 mg；含炙黄芪以黄芪甲苷计，不得少于0.01 mg。从测定结果可知，3批滇女金丸的含量均合格。