HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测的关系及对高危型人乳头瘤病毒感染引起宫颈病变的检出能力评估

彭海兰 黄梦丹 林桂兰 黄之文 罗爱华 黄 平

1.广东省高州市人民医院妇二科，广东高州 525200；2.广东省高州市人民医院检验科，广东高州 525200；3.广东省高州市人民医院病理科，广东高州 525200

宫颈癌属于妇科常见恶性肿瘤，发病率位居女性恶性肿瘤第3位，病死率高，对女性生命健康威胁严重[1]。研究指出，宫颈上皮内瘤变（CIN）时期是预防宫颈癌发生的黄金时期，在此时期进行干预可减少宫颈癌发生[2]。近年来，随着诊断水平的提升，研究发现高危型人乳头瘤病毒（HPV）E6/E7 mRNA可反映病毒的致癌活性，检测HPV E6/E7 mRNA可为临床诊断提供一定依据[3]。另有研究指出，p16/Ki-67双染检测技术能有效检出宫颈癌前病变，可降低宫颈癌前病变漏诊率[4]。两者均对宫颈病变诊断具有一定价值，但两者联合应用是否可进一步提升诊断效能的临床研究甚少。基于此，本研究选取高州市人民医院收治的200例高危型HPV感染患者进行研究，旨在探究HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测的诊断价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究经高州市人民医院医学伦理委员会审核通过。选取2020年1月至2021年4月高州市人民医院收治的200例高危型HPV感染患者作为研究对象，年龄21～60岁，平均（40.52±5.88）岁；体重指数 18.9～ 27.7 kg/m2，平均（23.56±1.51）kg/m2；孕次0～4次，平均（1.95±0.47）次。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：①均为高州市人民医院收治的高危型HPV感染女性，均存在不同程度下腹坠胀感、分泌物增多、阴道不规则出血、白带增多等症状；②均接受病理组织检查并明确病情；③均行HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测；④检查前3 d内无性生活、阴道用药；⑤宫颈完整；⑥均知情本研究，并签署同意书。排除标准：①合并重要器官功能障碍者；②精神异常、认知功能障碍者；③血液、免疫系统疾病者；④妊娠、哺乳期女性；⑤伴其他恶性肿瘤者。

1.3 方法

1.3.1 仪器及试剂盒 广州安必平医药科技股份有限公司提供p16/Ki-67试剂盒（批号：2007001）；广州安必平医药科技股份有限公司提供HPV E6/E7 mRNA试剂盒（批号：2105009）；广州安必平医药科技股份有限公司提供液基细胞仪（型号：DC-4212，序列号：KS-GD-0099）、生物显微镜（型号：CX43，序列号：9J51154）、多功能流式点阵仪（型号：Luminex 200，序列号：10017272422）；深圳市金科威实业有限公司提供阴道窥镜（型号：Slc-2000B）。

1.3.2 标本采集及制片 采用阴道张开器或窥阴镜使阴道充分暴露，收集足量分泌物、脱落细胞制成洗脱液，取1 ml液体置于HPV E6/E7 mRNA检测试管中，剩余液体制备2张宫颈细胞学薄片分别进行细胞学检查及p16/Ki-67双染检测。

1.3.3 p16/Ki-67双染检测 利用免疫细胞化学双染法的原理进行检测，病理科医师在显微镜下阅片，若视野中出现至少1个宫颈细胞的细胞质呈红色（p16），细胞核呈黄色或棕色（Ki-67）则判读为阳性；p16/Ki-67双染检测阳性标准：p16、Ki-67同时出现在一个细胞内，胞核红染、胞质棕黄染为阳性；只有一个显色或无显色为阴性。

1.3.4 HPV E6/E7 mRNA 采用多功能流式点阵仪实施扩增、显色，再在扩增体系中加入1 μl DNA抽提液，按照试剂盒扩增程序持续进行扩增反应，计算机读取检测结果，其中HPV E6/E7 mRNA拷贝数＜ 1.0 copy/ml为阴性，反之为阳性。

1.3.5 细胞学检查 采用液基细胞仪进行涂片染色，由专业医师按照《子宫颈细胞学Bethesda报告系统》[5]对涂片进行分析，分为未见上皮内病变或恶性病变（NILM）、未确定意义的非典型鳞状上皮细胞病变（ASCUS）、低度鳞状上皮内病变（LSIL）、高度鳞状上皮内病变（HSIL）、浸润癌。

1.3.6 病理组织检查 将阴道窥镜置入阴道，暴露阴道与宫颈连接部位，观察宫颈形态、大小等情况，采用阴道镜放大子宫颈图片，采用5%乙酸进行涂抹，在异常处取病理组织放入中性福尔马林缓冲液中固定8 h，再实施石蜡包埋切片、染色，进行病理学诊断，依据《WHO女性生殖器官肿瘤学分类（第4版）解读》[6]对宫颈组织学诊断结果实施评估，分为宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、浸润癌，其中NILM、CINⅠ为阴性，CINⅡ、CINⅢ、浸润癌为阳性。

1.4 观察指标及评价标准

①记录病理组织检查、细胞学检查、HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性结果。②比较不同细胞学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率。③比较不同病理学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率。④比较不同HPV E6/E7 mRNA表达情况患者p16/Ki-67双染检测阳性率。⑤分析HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测的关系。⑥以病理组织检查为“金标准”，统计HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测及联合检查对CINⅡ+的检查结果及诊断效能。联合检查阳性标准：任意单一检查为阳性即为阳性。CINⅡ+是指CINⅡ、CINⅢ、浸润癌。敏感度=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性+假阳性）例数×100%；准确度=（真阳性+真阴性）例数/（真阳性+假阴性+真阴性+假阳性）例数×100%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，多因素分析采用logistic回归分析法。P＜ 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理组织检查、细胞学检查、HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性结果

200例宫颈病变患者经病理组织检查证实 宫 颈 炎 54例、CINⅠ 45例、CINⅡ 39例、CINⅢ33例、浸润癌29例；经细胞学检查证实NILM 51例、ASCUS 41例、LSIL 31例、HSIL 47例、浸润癌30例；经HPV E6/E7 mRNA检出92例阳性，108例阴性；经p16/Ki-67双染检测检出84例阳性，116例阴性。

2.2 不同细胞学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率比较

随细胞学诊断级别的提升，HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率逐渐增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1。

表1 不同细胞学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率比较[n（%）]

2.3 不同病理学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率比较

随病理学诊断级别提升，HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测阳性率逐渐增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 不同病理学类型患者HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测阳性率比较[n（%）]

2.4 HPV E6/E7 mRNA与p16/Ki-67双染检测的关系

HPV E6/E7 mRNA阳性患者的体重指数、p16/Ki-67双染检测阳性率高于阴性患者，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；HPV E6/E7 mRNA 阳性、阴性患者间年龄、孕次比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表3。将体重指数、p16/Ki-67双染阳性占比作为自变量，HPV E6/E7 mRNA表达情况作为因变量纳入多因素logistic回归模型，结果显示，p16/Ki-67双染阳性为HPV E6/E7 mRNA阳性的危险因素。见表4～5。

表3 HPV E6/E7 mRNA阳性的单因素分析

表4 变量赋值

表5 HPV E6/E7 mRNA阳性的多因素分析

2.5 HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测及联合检查的检查结果及诊断效能

联合检查诊断CINⅡ+敏感度高于HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测单独诊断，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表6 ～ 7。

表6 HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测及联合检查的检查结果

表7 诊断效能[%（n/N）]

3 讨论

近年来随人们饮食习惯及生活方式改变，宫颈癌发病率逐渐增加且趋于年轻化，对女性生命健康产生严重威胁[7-8]。宫颈癌发生、发展时间较长，由癌前病变发展为宫颈癌需十年以上的时间[9]。因此及时发现癌前病变并准确鉴别，对减少宫颈癌发生、提高治疗效果、改善预后十分重要。

宫颈活检为诊断宫颈病变的“金标准”，但其为有创检查，且取材局限，导致患者难以接受，不利于疾病筛查[10]。因此，找寻一种简单、快速、准确地诊断宫颈病变的方式对患者十分重要。HPV E6/E7 mRNA为宫颈癌及癌前病变的致病因素，有研究指出，女性感染HPV后，约40%患者会发生宫颈上皮内瘤病变，且持续感染者病变率更高，因此测定患者HPV感染情况有助于区分宫颈病变等级[11]。p16属于抑癌基因，在多种肿瘤疾病中，p16均存在缺失、突变，造成细胞周期紊乱，细胞无限生长，引发癌变，但单独p16诊断仍依赖于细胞形态；Ki-67是反映细胞增殖的标志物，在正常细胞内p16、Ki-67不会同时表达，但其在宫颈高级别病变中具有较高的一致性，通过检测HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67表达情况可对宫颈病变进行诊断鉴别[12-13]。本研究通过分析不同细胞学、病理学类型的宫颈病变患者HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染阳性表达情况发现，随细胞学、病理学诊断级别的提升，HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染阳性率逐渐增加（P＜ 0.05），这一结果与国外 Celewicz等[14]研究结果一致，提示HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染阳性表达情况可一定程度地反映患者病变程度。本研究分析HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测结果关系发现，HPV E6/E7 mRNA阳性患者p16/Ki-67双染阳性率高于HPV E6/E7 mRNA阴性患者，这与国外相关研究类似[15]。这是由于女性感染HPV病毒后，病毒基因可与宿主基因发生整合，形成致癌蛋白E7，可影响细胞周期循环，使细胞增殖不受控制，导致p16过表达，且p16/Ki-67与HPV感染导致的癌性转化有关[16]。

本研究进一步分析HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测的诊断价值发现，联合检查诊断CINⅡ+敏感度高于HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测单独诊断（P＜ 0.05），由此说明联合 HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测诊断可提升对CINⅡ+的敏感度，有利于早期及时筛查，并制订针对性干预措施，以降低宫颈癌发生率。

综上所述，HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki-67双染检测联合用于诊断CINⅡ+的诊断价值敏感度更高，可为宫颈癌前病变筛查提供指导，同时可显著降低阴道镜转诊率，减少不必要的阴道镜转诊，防止过度诊断，协助临床医师对患者进行准确分层管理，进而实现患者早期干预。p16/Ki-67和HPV E6 /E7 mRNA作为宫颈病变发生、发展中重要的生物学标志物，其无创的检测特点受到患者的普遍认可。p16/Ki-67双染检测和HPV E6/E7 mRNA结果易于判读、具有更好的重复性和简便性，其临床应用价值较高。本研究存在一定不足，在后期的工作将继续扩大样本容量，深入研究p16/Ki-67双染检测、HPV E6/E7 mRNA和联合检测与宫颈癌前病变患者转归的相关性，以期更合理地对宫颈病变患者进行有效诊治。