早期乳腺癌患者化疗联合促性腺激素释放激素激动剂：一项单中心、双盲、随机对照临床试验

林威威 ，林确然 ，何钻玉 ，苏逢锡 ，潘萍 ，陈凯 *，杨冬梓 *

根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）2020 年发布的数据，乳腺癌已经超越肺癌，成为全球第一大癌症。仅2020 年一年，全球乳腺癌新增人数达226 万，占女性所有新发病例的24.5%［1］。同时，从2010 年到2019 年的十年间，乳腺癌导致的伤残调整寿命年（DALY）迅速增长，2019 年导致2060 万DALY，位列所有癌症的第四位，女性癌症的第一位［2］。我国 2020 年乳腺癌新发病例 41.6 万例［3］。在育龄妇女恶性疾病中，乳腺癌患者占40%以上［4，5］。其中华南地区的乳腺癌发病率总体与全国的中位数相当，具有较强的代表性［6］。据文献报道，乳腺癌的发病情况具有年轻化趋势［3］；此外，中国乳腺癌患者平均发病年龄较西方国家要早约10 年［7］。因此，在进行乳腺癌综合治疗时，需要重点关注治疗对生殖系统的副作用尤其是卵巢功能损害，例如诱发短暂或永久性闭经、卵巢早衰与不孕症等。尽管化疗可以延长生存时间，但其产生的对生殖系统的不良反应可能会影响年轻乳腺癌患者的生存质量，并有可能使患者及其家属对治疗方案的选择以及减弱其治疗的依从性进而影响疗效［8-11］。

本项目是首次在中国乳腺癌人群里探索促性腺激素释放激素激动剂（gonadotropin⁃releasing hormone agonist，GnRHa）的应用对于化疗后月经恢复和卵巢体积大小影响的一项单中心、随机、对照、双盲临床试验，并通过长时间的随访获得了长期的肿瘤学生存的安全性数据。以期建立和完善早期乳腺癌化疗过程中应用GnRHa 类药物保护生殖系统功能（生育功能和内分泌功能）的方法。

1 材料与方法

1.1 纳入和排除标准

本试验经中山大学中山纪念医院伦理委员会批准，中国临床试验注册中心（ChiCTR⁃TRC⁃10000980）。获得每个受试者的书面知情同意。试验方案和统计分析方案见附录。试验遵循了CONSORT 报告指南和中国《药品临床试验管理规范》以及国家相关法规进行。

1.2 入选标准

所有受试者必须符合下列标准：①年龄14~45 岁女性；②临床诊断为早、中期乳腺癌患者；③预备接受化学治疗，且预期生存超过12 个月；④签署知情同意书并能按时随访；⑤妊娠试验阴性并同意在研究开始后的1 个月内采取有效的非激素避孕法。

1.3 排除标准

如果具备以下任何一项，不可进入研究：①生殖器官肿瘤，或怀疑肿瘤已有生殖器官转移；②合并严重心脑、呼吸和肝肾系统疾病；③合并精神疾病、严重神经官能症或认知障碍；④妊娠或哺乳；⑤已知对GnRH 激动剂过敏；⑥已经有卵巢功能衰竭症状；⑦既往已接受过化疗药物；⑧已接受或预备接受局部或大范围放射治疗。

在额外排除6 名在完成化疗前就退出研究的志愿者，我们在当前的研究中纳入了141名受试者。

1.4 研究设计及处理

该试验是一项由研究人员发起的、单中心、随机、双盲临床对照试验，于2008 年8 月至2021 年12 月在中山大学孙逸仙纪念医院进行，完成用药后患者随访时间从8年~13年不等。干预组患者于化疗前0~14 天肌注GnRHa（达菲林，注射用醋酸曲普瑞林）3.75 mg，每28 天重复用药，伴随化疗，用药不超过6 个月。随机分至安慰组的受试者在上述同时间接受安慰剂（生理盐水）肌肉注射。根据患者的诊断分配化疗方案，化疗方案以蒽环和/或紫杉类药物为主，并参考NCCN 指南制定［12］。记录治疗期间发生的不良事件，当发生严重的不良反应时会采取相应保护措施或停止治疗。每例患者在治疗前记录月经情况、激素水平、妇科B 超检查结果。所有患者在治疗结束后首先随访2 年以记录疗效和安全性，再继续随访以观察远期疗效。

1.5 随机化分组

本试验采用分层随机化区组分配方案将全部入选病例分到GnRHa 激动剂试验组和对照组。分层随机化区组分配方案使用SPSS 10.0 for Win⁃dows 统计软件完成，利用计算机随机数生成器产生随机码来分配区组，区组的长度随机变化。具体的随机化方法由中山大学公共卫生学院统计学教研室选派统计学家负责实施（该统计学家不参加临床用药、随访、数据采集以及最终的数据统计分析和汇总），完成的随机方案用一组不透明信封隐藏，为每一个受试者设置一个应急信件（Emer⁃gency letter），信件内容为该编号的受试者所分入的组别。应急信件密封后随相应编号的试验药物发往各试验中心，由中心负责人保存，在发生紧急情况（如遇严重不良事件必须知道病人接受的是何种处理）时方可由中心负责人拆阅，一旦被拆阅，该编号病例就作为脱落病例处理，所有应急信件在试验结束后随病例报告表一起收回。

1.6 主要研究终点

对比干预组和对照组化疗结束后6、12 个月的月经恢复率来分析月经恢复情况。

1.7 次要研究终点

①GnRHa 的使用与丙氨酸转氨酶（ALT）与左右卵巢容积（长径×左右径×前后径×0.523）及窦卵泡计数（AFC）之间的关系。

②化疗6 个月后月经恢复和月经未恢复的患者的死亡（Death），转移（Metastasis）和复发（Re⁃lapse）：（包括死亡和转移事件）。

1.8 数据分析

本研究采用卡方检验来评估干预组与对照组月经恢复率差异的意义。采用Logistic 回归分析评价化疗结束及化疗后6 个月干预与月经恢复之间的关系。采用线性回归建立干预组与丙氨酸转氨酶、窦卵泡数、左右卵巢容积的相关性模型。使用Cox 风险回归来评估化疗6 个月后月经状况、左右卵巢容积与全因死亡、转移和复发之间的关系。协变量调整使用了分层因素包括年龄，肿瘤分期，和化疗方案。使用Kaplan⁃Meier（K⁃M）曲线和Log⁃rank test 来探讨两组患者间无转移生存期（metastasis⁃free survival，MFS）和无复发生存期（relapse⁃free survival，RFS）的差异。本研究采用STATA 15IC 软件进行统计分析。

2 结果

2.1 两组人群基线特征比较

GnRHa 干预组的患者入组时的平均年龄为34.5±4.5，有34（50.7%）位患者≤35 岁。月经初潮的平均年龄为13.6±1.2 岁，入组前六个月100%没有闭经。干预组患者的左，右两侧卵巢平均容积分别为4.8±2.3 cm 和7.1±14.8 cm。平均丙氨酸转氨酶为14.1±8 U/L，窦卵泡计数平均为14±7.4 个。在对照组的患者里面，他们的平均年龄为34.5±5.5岁；≤35 岁的有34（49.3%）人；月经初潮平均年龄为13.7±1.2 岁；入组前六个月100%有过至少一次月经；左右侧卵巢平均容积分别为6.1±5.0 cm 和5.6±3.1 cm；平均丙氨酸转氨酶为15±10.5 U/L，窦卵泡计数平均为15±9.4 个。对比干预组和对照组的各项基线变量后，所有均P值>0.05，显示两组患者入组时的各项特征无显著性差异。因此，两组患者用药后情况具有可比性（表格1）。

2.2 GnRHa 的应用对乳腺癌患者化疗后月经恢复率的影响

化疗前GnRHa 干预组和对照组的患者入组前半年内有月经的比例均为100%。在六个月化疗结束时，干预组的患者有过月经的人数为3人（占4.6%）。对照组的月经恢复人数为14人（占20.0%），两组差异具有统计学意义（P=0.006）。两组的月经恢复情况在化疗结束后6 个月比较无统计学差异。干预组有69.2%的患者恢复了月经，对照组的患者有75.9%恢复了月经（P=0.436）（表2）。在多因素分析过程中对年龄、疾病分期、化疗方案进行进一步矫正后，我们观察到在化疗结束时，干预组对比对照组的月经恢复率的差异无统计学意义（OR=0.19，95%CI：0.03~1.14）；在化疗结束六个月时，是否使用GnRHa 对于月经恢复无显著相关性（P>0.05）（图1）。

表2 两组患者化疗不同阶段月经恢复情况对比

表1 两组患者基线特征对比

2.3 GnRHa 的应用对乳腺癌患者化疗后的肝功能、卵巢体积的影响

在多因素分析过程中对年龄、疾病分期、化疗方案进行进一步矫正后，在化疗结束时，我们观察到干预组患者的左右卵巢容积均与对照组无显著差异（差值：-1.63，-3.95，P=0.073，P=0.108）；干预组患者中的平均转氨酶比对照组患者更低，但是差异无统计学意义（差值：-1.94，P=0.675）；平均窦卵泡计数（AFC）在干预组中的数值相比对照组更少，差异有统计学意义（差值：-2.2，P=0.028）。在化疗结束六个月时，是否使用GnRHa 对于左右卵巢容积和窦卵泡计数均无显著相关性（P>0.05）（图1）

图1 GnRHa 的应用对乳腺癌患者化疗后的肝功能、卵巢容积、月经恢复的影响LOV 代表左侧卵巢容积，ROV 代表右侧卵巢容积，ALT 为转氨酶，AFC 为窦卵泡计数；V7 代表化疗结束时的情况，V8 代表化疗结束6 个月的时候的情况

2.4 化疗结束后月经恢复情况和预后的相关性

在化疗结束后六个月时，月经恢复的78 人里面有6 人在随访的最后发生死亡，11 人发生了肿瘤转移和13 人发生了复发的情况；在月经没有恢复的27 个人里面，有1（3.7%）人发生了死亡事，6（22.2%）发生了肿瘤转移，9（33.3%）发生了复发；χ2检验显示两组的预后情况无统计学差异（表格3）。在多因素分析过程中对年龄、疾病分期、化疗方案进行进一步矫正后，化疗结束六个月的月经恢复情况与死亡事件、转移和复发没有显著的相关性（P>0.05）（图2）。化疗结束后左侧卵巢容积与死亡事件，转移，和复发不显著相关（P>0.05）。但是同一时间右侧卵巢容积与转移事件呈负相关（HR=0.76，P=0.046），与死亡和复发风险没有统计学显著相关性（P>0.05）（图2）。干预组和对照组患者以转移和复发为结局的Kaplan⁃Meier（K⁃M）曲线如图 3 所示，根据 Log⁃rank test 结果，两组患者间转移和复发时间的无统计学差异（P=0.3352，P=0.0999）。

图3 干预对照两组患者的转移和复发的K⁃M曲线和log⁃rank test的P值

表3 化疗结束后六个月两组月经恢复情况患者中预后的对比 ［n（%）］

图2 化疗结束后月经恢复情况和预后的相关性

3 讨论

本研究是一项单中心、双盲、随机对照临床试验，所有的患者都接受了4 至6 个周期的化疗，随访时间长达13 年，在受试人群中评估了GnRHa 对乳腺癌化疗后月经恢复及卵巢大小的效果和安全性，以期建立和完善乳腺癌化疗期间使用GnRHa类药物保护卵巢的方法，结果显示使用GnRHa 与患者化疗结束后的月经恢复情况和卵巢大小无明显关系，而右侧卵巢容积的恢复对乳腺癌转移有保护作用。目前已有研究表明，在化疗期间使用GnRHa 可显著降低闭经率［13-16］。然而我们的结果表明，年龄14~45 岁的女性且临床诊断为早、中期乳腺癌的患者，化疗期间使用GnRHa 治疗时，对照组和干预组之间的月经恢复率、左右卵巢容积及转氨酶没有明显差异，且化疗后的月经恢复情况，左卵巢容积对全因死亡，乳腺癌转移或复发无显著影响，右侧卵巢容积与肿瘤转移则显著负相关。对入组的141 名患者进行分析的结果显示，在化疗结束后的6 个月，对照组月经恢复了75.9%，治疗组为69.2%。因此，本研究的疗效指标评估显示GnRHa 和月经恢复无明显关系。

在一项GnRHa 在乳腺癌辅助化疗中维持卵巢功能的随机试验中也显示，按年龄、雌激素受体状态和治疗方案分层时，治疗组的闭经率与对照组相当，并且为了限制观察的偏差，使用了比例风险模型来评估治疗药物是否会对月经时间有影响，结果显示与对照组相比，未观察到影响［17］，本项目所观察的结论与之一致。我们研究得到阴性结果的另一个潜在原因也可能是由于参与者平均年龄为34.5 岁，普遍比较年轻，因此不论使用GnRHa与否的月经恢复率都比较高。在另一项使用促黄体生成素释放激素激动剂（luteinizing hormone⁃releasing hormone agonists，LHRHa）的随机对照试验中显示，绝经前乳腺癌患者同时接受辅助化疗，化疗结束后6 个月与单独接受化疗的患者相比，闭经减少无统计学意义［18］。在其他几项研究中则显示化疗期间使用GnRHa 可显著降低闭经率［13-16］，至随访结束，治疗组闭经发生率为22.8%~15.8%，平均年龄为40.6岁，中位随访时间为49~60.5个月，ER 阳性率为10.3%~13.0%。而在我们的研究中，平均年龄为34.5 岁，雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性率分别为71.8%（治疗组）和70.3%（对照组）。在这些研究中，化疗方案包括TEC（多西紫杉醇+阿霉素+环磷酰胺），EC⁃T（H）（阿霉素+环磷酰胺4 个周期，随后再加4 个周期的多西他赛±曲妥珠单抗），TC（H）（多西紫杉醇+环磷酰胺±曲妥珠单抗）和FEC（5⁃氟尿嘧啶+阿霉素+环磷酰胺），这与我们主要的研究方案较一致。在本研究中，右侧卵巢容积与肿瘤转移及复发则显著负相关，且每增加一个单位，转移风险就减少24%，此项结论目前尚未在文献中有见报道。最后，干预组患者中的平均AFC 在用药结束时相比对照组更低。这个情况是由于GnRHa 的降调作用导致的，在停药6 个月后两组患者的平均AFC 值变为无显著差异，提示GnRHa 对治疗结束后患者的AFC 值无显著影响。

总之，本研究中在治疗结束后，GnRHa 治疗组的月经恢复率为69.2%，对照组为75.9%，无统计学差异。这些结果表明，与未接受GnRHa 治疗的患者相比，接受GnRHa 治疗对月经恢复和卵巢大小无明显益处，关于两组患者的卵巢功能影响以及生育率的影响差异的数据观察目前本研究仍然在进行。本文主要结果显示GnRHa 对肝脏无明显毒性也不会影响化疗结束后窦卵泡计数，并且也不影响患者的复发、转移风险。因此使用GnRHa 用于化疗病人的卵巢保护总体而言是安全的。另外，乳腺癌患者早期化疗过程中可用于保留卵巢功能/保留生育能力的方法也有许多其他方式可供选择。如在接受化疗前进行卵母细胞或胚胎冷冻低温保存［19］是一种常用的保留生育能力方法。据我们所知，本研究是第一个针对中国人群开展的GnRHa 用于乳腺癌化疗过程的一项随机对照临床试验，基线数据匹配，可分析数据完整，结果较可靠。此外，本研究也存在一些缺陷，本研究样本量较小，未将治疗结束后的生育情况作为研究的结局，并且最终参与研究的人数并未达到预期的要求，还需要更大规模的研究来阐明GnRHa 在保护年轻的乳腺癌患者卵巢功能方面的作用。