联合应用常染色体STR和SNP排除半同胞关系1例

徐倩南，朱如心，姜磊，李成涛，刘希玲

1.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 司法部司法鉴定重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.河南科技大学基础医学与法医学院，河南 洛阳 471000

1 案 例

1.1 简要案情

宋某（男性）和魏某（女性）委托本院对两者之间有无生物学半同胞关系进行检验。

1.2 检验过程

按照《法庭科学DNA 实验室检验规范》（GA/T 383—2014）对两名被鉴定人（宋某和魏某）的血纱布进行DNA 提取。

1.2.1 常染色体STR 基因座检测

分别采用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统（司法鉴定科学研究院研发）、Goldeneye®DNA 身份鉴定系统22NC［基点认知技术（北京）有限公司］和21+1 STR 荧光检测试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）对两名被鉴定人的常染色体短串联重复序列（autosomal-short tandem repeat，A-STR）基因座进行复合PCR 扩增，用3130xl基因分析仪（美国Applied Biosystems 公司）进行毛细管电泳和基因型分析。

1.2.2 常染色体SNP 位点检测

采用ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒（美国Verogen公司）的引物混合物A对两名被鉴定人的94个常染色体单核苷酸多态性（autosomal-single nucleotide polymorphism，A-SNP）位点进行文库构建，用MiSeq FGx 测序系统（美国Verogen 公司）进行高通量测序和基因型分析。由于检测所用的引物混合物A中除含94 个A-SNP 外，还含27 个A-STR，因此同时还得到27 个A-STR 的分型信息，这27 个A-STR 均包含在1.2.1 节所述的三款A-STR 检测试剂盒所测基因座中。

1.2.3 指数计算

采用似然比法[1]计算半同胞指数（half sibling index，HSI）和累积半同胞指数（cumulative half sibling index，CHSI）。

1.3 检测结果

1.3.1 A-STR 检测结果

利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统检测了21 个A-STR，其CHSI 值为0.001 7。利用Goldeneye®DNA 身份鉴定系统22NC 检测了21 个A-STR，其CHSI 值为0.241 6。利用21+1 STR 荧光检测试剂盒检测了21 个A-STR，其CHSI 值为6.943 9。去除三款试剂盒中的重复基因座，共含55 个A-STR（表1），其CHSI 值为0.008 9。

表1 55 个A-STR 的分型结果Tab.1 Typing results of 55 A-STRs

1.3.2 A-SNP 检测结果

ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒的引物混合物A 检测了94 个A-SNP，除13 个A-SNP 未在两名被鉴定人中成功得到分型结果外，其余81 个A-SNP的分型结果均成功获得（表2），经计算，其CHSI 值为0.006 9。

表2 81 个A-SNP 的分型结果Tab.2 Typing results of 81 A-SNPs

1.3.3 联合应用A-STR 和A-SNP 的HSI 计算结果

联合应用A-STR 和A-SNP 分型结果计算CHSI，其中：（1）利用ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得27 个A-STR 和81 个A-SNP，其CHSI 值为6.483 3×10-5；（2）利用21+1 STR 荧光检测试剂盒的21 个ASTR和ForenSeq DNA Signature Prep试剂盒所得81个A-SNP，其CHSI值为0.048 2；（3）利用Goldeneye®DNA身份鉴定系统22NC 的21 个A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得81 个A-SNP，其CHSI 值为0.001 7；（4）利用21+1 STR 荧光检测试剂盒和Goldeneye®DNA 身份鉴定系统22NC 两个试剂盒的37 个ASTR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep试剂盒所得81个A-SNP，其CHSI值为0.004 6；（5）利用SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统的21 个A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得81个A-SNP，其CHSI值为1.148 3×10-5；（6）利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统和Goldeneye®DNA身份鉴定系统22NC的39 个A-STR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep 试 剂盒所得81 个A-SNP，其CHSI 值为1.022 9×10-5；（7）利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统和21+1 STR荧光检测试剂盒的40 个A-STR 以及ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得81 个A-SNP，其CHSI 值为4.649 0×10-5；（8）利用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统、Goldeneye®DNA 身份鉴定系统22NC 和21+1 STR 荧光检测试剂盒的55 个A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得81 个A-SNP，其CHSI 值为6.181 6×10-5。

1.4 鉴定意见

联合应用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统、Goldeneye®DNA 身份鉴定系统22NC 和21+1 STR 荧光检测试剂盒的55个A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得81 个A-SNP 的分型结果计算，可得CHSI值为6.181 6×10-5。依据现有资料和DNA 分型结果综合分析，倾向于认为宋某与魏某为无关个体。

2 讨论

生物学半同胞关系鉴定在日常检案中的数量逐年增多，但由于技术手段的限制和相应鉴定规范的缺乏，一直以来是司法鉴定实践中的难点。通常，包括半同胞关系鉴定在内的复杂亲缘关系鉴定可根据多个被鉴定人进行家系重建，并根据A-STR 分型结果推断父母基因型，从而推断被鉴定人之间的亲缘关系[2]。也有学者[3-6]提出同时检测A-STR、性染色体STR 或mtDNA 来进行半同胞关系的判定。本例中只有两人参与鉴定，且性别不同，使得Y-STR 无法发挥其应用价值，X-STR 的应用价值也极为有限[4]。通过mtDNA 高变区（hypervariable region，HVR）Ⅰ和Ⅱ的序列分析仅可在同母异父半同胞关系鉴定中用于辅助推断，无法为半同胞关系的认定提供有力证据[4]，同时，mtDNA 全序列的测定需在二代测序平台上进行[3，7]，对样本质量要求较高。本例样本为带血纱布，所含血样较少，无法满足测定mtDNA 全序列对样本的要求。因此，联合应用多种常染色体遗传标记成为解决本例的重要策略，已有研究[8-9]报道联合应用ASTR 和A-SNP 可为半同胞关系鉴定提供可靠依据。

基于上述分析，本例选用三款A-STR 分型试剂盒以及基于MiSeq FGx 测序系统的ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒，其中ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒可 同时检测27 个A-STR 和94 个A-SNP，其灵敏度可低至200 pg[10]，对样本质量的要求较低，但本例样本为带血纱布，所含血样较少，使得提取所得DNA 量极其有限，因此，在系统默认参数下成功得到81 个A-SNP 的分型结果，依然有13 个A-SNP 未得到分型结果。本例在对分型结果进行统计分析时，还计算了各个试剂盒分型结果下的CHSI 值。ZHANG等[9]研究了联合使用21+1 STR 荧光检测试剂盒和ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒在亲缘关系鉴定方面的价值，由于ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒可同时检测27 个A-STR，其中有8 个与21+1 STR 荧光检测试剂盒共有，因此最终探讨了40 个ASTR 和91 个A-SNP 在亲缘关系鉴定中的应用，计算了全同胞关系指数和部分二级亲缘关系指数，并通过设定单边阈值判定亲缘关系，结果表明，将阈值设定为1、10、100 或1 000 时，判定二级亲缘关系的灵敏度、特异性和准确性均无法达到100%。LI 等[8]研究ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒在提高亲缘关系鉴定效能的表现时，通过计算所测27 个A-STR 和94 个A-SNP 的似然率，设置双边阈值来判定个体之间的亲缘关系。在判定二级亲缘关系时，将较低阈值设定为0.000 1，较高阈值设定为10 000，即当二级亲缘关系指数小于0.000 1 时判定两者为无关个体，当二级亲缘关系指数大于10 000 时判定两者为二级亲缘关系，以此使得整个检测系统的阳性预测值（指被正确判定为有关系个体的比例）和阴性预测值（指被正确判定为无关个体的比例）均达到100%。半同胞关系属于二级亲缘关系的一种，本例通过联合使用55 个A-STR 和81 个A-SNP，得到CHSI 值为6.181 6×10-5，小于0.000 1，倾向于认为两者为无关个体。

此外，联合应用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统和21+1 STR 荧光检测试剂盒的40 个A-STR以及ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得81 个A-SNP 或联合应用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统和Goldeneye®DNA 身份鉴定系统22NC 的39 个A-STR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep试剂盒所得81 个A-SNP，也倾向于认为两者为无关个体。甚至仅联合应用SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统的21 个A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 试 剂盒所得81 个A-SNP，所得CHSI 值也小于0.000 1，同样倾向于认为两者为无关个体。若单独使用ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得27 个A-STR 和81 个A-SNP 计算，也得出相同的结论，且相较于SiFaSTRTM23plex DNA 身份鉴定系统的21 个A-STR，还增加了6 个A-STR（D17S1301、D20S482、D22S1045、D2S441、D4S2408和D9S1122）。而联合应用21+1 STR 荧 光检测试剂盒的21 个A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得81 个A-SNP 或Goldeneye®DNA身份鉴定系统22NC 的21 个A-STR 和ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得81 个A-SNP，无法得出可靠结论。同样的，联合应用21+1 STR 荧光检测试剂盒和Goldeneye®DNA 身份鉴定系统22NC 的37 个ASTR 以 及ForenSeq DNA Signature Prep 试剂盒所得81 个A-SNP，也无法得出可靠结论。由此可见，仅增加所测常染色体基因座的数量有时并不能达到提高亲缘关系鉴别能力的目的。本例首先考虑使用基于毛细管电泳平台的三款试剂盒以期得出结论，在发现使用55 个A-STR 无法得到明确结论后，再采用二代测序试剂盒加测A-SNP，从而在保证节省人力物力的情况下得到更多信息来支撑最终的鉴定意见。

近年来，随着检测技术的提高，越来越多的遗传标记可通过二代测序平台进行测定，大大提高了包括半同胞关系鉴定在内的复杂亲缘关系的检测效能。但在实际案件中，应根据案件的独特性挑选适合的遗传标记进行检验，而不是一味追求遗传标记数量的增多。目前关于半同胞关系鉴定的相关研究依然较少，且无针对性的行业标准颁布，使得半同胞关系的甄别依然存在较大的风险，因此，在今后的类似案件中，应根据情况结合多方数据综合分析判断。