死后溶血及超滤处理对肌酐检测结果的影响

贾宇晴，王天琦，赵锐，朱宝利，曹志鹏

1.中国医科大学法医学院法医病理学教研室 辽宁省法医学生物证据重点实验室 中国医科大学司法鉴定中心，辽宁 沈阳 110122；2.辽宁大学司法鉴定中心，辽宁 沈阳 110031；3.德国海德堡大学法医学与交通医学研究所，德国 海德堡 69115

利用死后血清中尿素、肌酐水平评估生前氮质血症状态及其严重程度，在急、慢性肾功能衰竭，致命性高（低）温损伤，高渗性脱水等死因诊断中具有重要的辅助诊断价值[1-3]。研究[4]表明，体液中尿素、肌酐水平在死后早期相对稳定，受死后变化影响较小。然而在我国，由于尸体多以冷冻方式储存，在死后早期经缓冻的尸体会发生严重的溶血[5-6]。目前，包括尿素及肌酐在内的绝大多数生物化学指标主要依赖生物化学方法检测，样本溶血是干扰其检测最重要的原因[7-8]。因此，降低溶血对死后生物化学检测的干扰是目前亟待解决的问题。

为降低溶血对血液样本中尿素检测的干扰，本课题组在前期研究[5]中采用超滤技术截留溶血样本中血红蛋白等大分子物质，有效降低了溶血对尿素检测的干扰。超滤是利用超滤膜表面的微细孔径截获流体（溶血样本）内一定分子量的物质，从而达到去除或截留流体中目标物质的目的[9]。由于其操作简便、高效、低成本等特点，被广泛应用于血液透析、水质净化、生物制药等诸多领域[9-10]。本研究拟在前期研究的基础上，探讨死后溶血对血液样本中肌酐检测的影响以及超滤处理是否可降低其干扰。

1 材料与方法

1.1 样本来源及纳入标准

血液样本收集于中国医科大学司法鉴定中心2018 年9 月—2019 年3 月受理并进行系统尸体检验的案例，共33例。在尸体检验过程中利用无菌注射器从左心室抽取全血样本，每例15 mL。为保证血液未发生溶血，纳入标准为：（1）尸体未经冷冻保存；（2）死后48 h 内进行尸体解剖[4]；（3）在满足第1、2 项要求的基础上所提取的左心血液经离心后可分离出无肉眼可见溶血的血清。

本研究已获得中国医科大学伦理委员会批准。

1.2 多梯度溶血样本的制备

每例全血样本中抽取5 mL 立即以4 000×g离心10 min 后收集血清，测定血清中肌酐浓度（即基线肌酐浓度），对于脂血样本（血清明显脂浊），将血清进行高速离心可降低血液中脂质成分对生物化学检测的干扰[11-12]。其余10 mL 用于制备多梯度溶血样本。

8 例全血样本分别抽取其10%～20%体积的血液，5 例全血样本分别抽取其40%～60%体积的血液，经反复冻融3 次（-20 ℃冷冻、4 ℃解冻）后，注入原全血样本，轻柔混合后以4 000×g离心10 min，取上层溶血血清。另外20 例全血样本直接进行反复冻融3 次（-20 ℃冷冻、4 ℃解冻）后-20 ℃冷冻保存待用。检测上述人工溶血样本中的血红蛋白质量浓度，并据其将33 例溶血样本分为H1～H4 4 个梯度：H1，＜50 g/L（n=8）；H2，50～＜100 g/L（n=9）；H3，100～＜150 g/L（n=6）；H4，≥150 g/L（n=10）。对制备的33 例溶血样本各取250 μL 检测其肌酐浓度，其余部分进行超滤处理。

1.3 超滤处理

方案1：从人工溶血样本中取1 mL注入Centrifree®超滤管（膜孔径为30 000 NMWCO，美国Merck 公司）中，固定角转子离心（2 000×g，30 min）后收集超滤液。当超滤液足够250 μL 时，检测其肌酐浓度；若不足250 μL，弃用，采用方案2 进行超滤处理。

方案2：利用无菌注射器取3～5 mL 溶血样本经MicroKros®中空纤维超滤组件（美国Spectrum Laboratories 公司）进行超滤，膜孔径为50 000 NMWCO，膜面积为20 cm2。收集约500 μL 初步超滤液，将其转移至Amicon Ultra-0.5超滤管（膜孔径为30 000 NMWCO，美国Merck 公司）中，固定角转子离心（14 000×g，10 min）后收集超滤液并检测其肌酐浓度。

1.4 生物化学检测

血红蛋白质量浓度采用文齐氏液（氰化法测定，天津市现代高科技研究院中山研究所）使用UV-1800紫外分光光度计（日本岛津公司）进行检测。肌酐浓度采用肌酐测定试剂盒（改良JAFF 法，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）使用MOL-300 全自动生化分析仪（上海艾诺电子有限公司）进行检测。

1.5 统计分析

本研究以人工溶血前血清中的肌酐浓度作为基线肌酐浓度，溶血样本、超滤液中肌酐浓度偏离基线肌酐浓度的程度［偏倚（B）］作为所受干扰的评价指标。B的计算公式如下：

式中，C溶血样本或超滤液表示溶血样本或超滤液中的肌酐浓度，C血清表示基线肌酐浓度。

使用SPSS 26.0 软件（美国IBM 公司）进行数据分析及ROC 曲线作图，使用GraphPad Prism 8.02 软件（美国GraphPad Software 公司）进行相关性分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 溶血样本超滤方案的选择

溶血样本的颜色随血红蛋白质量浓度的增高逐渐由透明的淡红色变成暗红色。经超滤后，其超滤液均为无色透明的溶液。

33 例中，经方案1 超滤后，13 例溶血样本［血红蛋白质量浓度为（41.15±33.53）g/L］获得了足够进行生物化学检测的超滤液；20 例溶血样本［血红蛋白质量浓度为（143.87±52.14）g/L］的超滤液不足250 μL，采用方案2 进行超滤处理后获得了足够进行生物化学检测的超滤液。

2.2 溶血样本在超滤前后肌酐检测的偏倚

表1 总结了H1～H4 各组基线肌酐浓度、溶血样本中血红蛋白质量浓度、溶血样本经超滤前后的肌酐浓度及其偏倚情况。随着溶血样本中血红蛋白质量浓度的增高，其偏倚逐渐增大，最高为589.06%（r=0.84，P＜0.05），经超滤后偏倚最高为32.14%，其余样本在±30%内。H1 和H2 组因溶血程度相对较低，超滤前后差异无统计学意义（P＞0.05），溶血程度较高的H3和H4 组在超滤后所受干扰降低（P＜0.05）。

表1 各组溶血样本的血红蛋白质量浓度、超滤前后的肌酐浓度及其偏倚Tab.1 The hemoglobin mass concentration，creatinine concentration and the bias（B）before and after ultrafiltration in the hemolyzed samples of different groups

2.3 溶血样本超滤前后肌酐浓度与基线肌酐浓度间的相关性

随着溶血程度的增加，溶血样本的偏倚逐渐增大，经Pearson 相关性分析，溶血样本肌酐浓度与基线肌酐浓度间的相关性无统计学意义（P=0.472 7，r=0.129 5），超滤处理后所受溶血干扰程度降低且较集中，超滤液中肌酐浓度与基线肌酐浓度间呈正相关（P＜0.05，r=0.918 2），详见图1。

图1 溶血样本超滤前后肌酐浓度与基线肌酐浓度间的相关性Fig.1 Correlation between creatinine concentrations before and after ultrafiltration in hemolyzed samples and baseline creatinine concentrations

2.4 溶血样本超滤前后其肌酐浓度诊断价值的初步评估

33 例溶血样本中，3 例（H2、H3、H4 组各1 例）的基线肌酐浓度（245.48～392.43 μmol/L）高于221.03 μmol/L[13]；9 例在超滤前肌酐浓度（225.98～722.34 μmol/L）高于221.03 μmol/L，其中7例为假阳性，均分布在H3和H4 组中，H4 组出现1 例假阴性样本（基线肌酐浓度为245.48 μmol/L，溶血样本肌酐浓度为176.92 μmol/L）。

超滤后，超滤液中未观察到假阳性样本，H4 组出现1 例假阴性样本（与溶血样本中的假阴性案例为同一案例，超滤液中肌酐浓度为181.94 μmol/L）。ROC分析结果（图2）显示：溶血样本的AUC 为0.78，P=0.117 5；超滤液的AUC 为0.99，P=0.005 9。

图2 溶血样本超滤前后的ROC 曲线Fig.2 ROC curves of hemolyzed samples before and after ultrafiltration

3 讨论

血液中肌酐浓度已被证实在死后早期相对稳定，在急、慢性肾功能衰竭，致命性高（低）温损伤，高渗性脱水等涉及氮质血症的死因分析中可作为可靠的生物化学参考指标[1-4，14-18]。尸体其他体液的相关研究[1，14]发现，心包液中肌酐浓度与血液相近，玻璃体液、脑脊液等体液中肌酐浓度显著低于血液，因此，当血液样本不可用时，心包液可谨慎用于替代血液进行肌酐检测。由于我国尸体常选择冷冻保存，使得心包液易受溶血影响，且目前尚无心包液中肌酐的死后参考值范围，故较难用于实际鉴定。同时，大部分机构以血液为常规采集的体液样本，基于上述原因，本研究以血液作为受试对象。

溶血样本中的血红蛋白可干扰大部分依靠光电比色法原理进行检测的生物化学指标，尽管临床上有文献报道肌酐检测还受到样本内葡萄糖及胆红素等物质的干扰，但对于死后生物化学检测而言，溶血样本中高质量浓度的血红蛋白是最主要的干扰物质[7-8]。

本课题组前期研究[5]结果表明，严重溶血的血液样本无法用于尿素的死后检测。本研究也显示出类似的结果：随着溶血样本中血红蛋白质量浓度的增加，溶血样本中肌酐所受干扰也逐渐增加，偏倚最高可达589.06%，因偏倚波动较大，故与基线肌酐浓度间的相关性无统计学意义（P=0.472 7，r=0.129 5），因此也难以利用回归分析等统计方法进行数据校正。

本研究所使用的超滤管及中空纤维超滤组件为市售的常见超滤耗材，适用于小体积流体样本且成本低廉。在33 例溶血样品中，有13 例血红蛋白质量浓度相对较低［（41.15±33.53）g/L］的样本仅利用30 000 NMWCO 超滤管即可获得足够的超滤液进行检测（＞250 μL）；20 例溶血样本因血红蛋白质量浓度较高［（143.87±52.14）g/L］，利用上述超滤方案无法获得足够的超滤液进行检测，因此，采用较大孔径（50 000 NMWCO）的中空纤维超滤组件去除部分血红蛋白后，再利用30 000 NMWCO 超滤管离心，获得足够的超滤液进行生物化学检测。溶血样本经超滤处理后，超滤液为无色透明的溶液，分子量约65 000 的血红蛋白被完全滤除。因H1、H2 组溶血程度相对较低，超滤前后偏倚差异无统计学意义。溶血程度较高的H3、H4 组经超滤后偏倚显著降低，同时，因超滤液与基线肌酐浓度间呈正相关（P＜0.05，r=0.918 2），为进一步建立溶血样本中肌酐浓度的回归方程提供了可行的前处理方案。在诊断价值上，因受溶血的干扰，溶血样本中的肌酐浓度常显著高于其真实浓度，导致易出现假阳性（7/33），缺乏诊断价值（P=0.117 5）。超滤液中未出现假阳性样本，ROC 分析初步显示其可能具有良好的诊断价值，但受样本量限制，本研究尚无法界定诊断阈值。在H4 组中存在同一案例在超滤前后均为假阴性，考虑可能由于本例的基线肌酐浓度（245.48 μmol/L）较为接近阈值（221.03 μmol/L[13]）所致。临床检验医学具备完整的质量保证及控制体系，受限于死后尸体样本的特殊性，直接套用临床标准则过于苛刻且不利于实际工作，因此，建立针对死后样本的检验质量控制体系、诊断标准等也是今后进一步研究的方向之一[19]。

本研究亦存在较多局限。在方法学方面，受样本量限制，本研究仅初步探究了血红蛋白被滤除后是否能够降低其对肌酐检测的干扰，尚未就两种超滤方案的差异进行更深入的探讨。在诊断性能方面，超滤液中肌酐浓度诊断肾功能损伤的阈值及其敏感性及特异性在本研究中尚无法确定，因此，直接利用超滤液中肌酐浓度进行辅助死因诊断的具体参考范围等仍有待进一步研究。

综上所述，血液样本溶血将严重干扰肌酐的死后检测，经超滤处理后可显著降低其偏倚，且与溶血前血清间呈正相关。本研究为进一步建立溶血样本中肌酐检测值的回归方程以及确定超滤液中肌酐的诊断阈值等提供了初步研究基础，也为超滤液中全系列多生物化学指标同时分析提供了一种可行的预处理方法。