青花菜Whirly基因的克隆、系统进化及表达特征分析

荆赞革， 裴徐梨， 李成慧， 唐 征， 冯鹏宇

(1.昆明学院农学与生命科学学院，昆明 650214；2.温州科技职业学院农业与生物技术学院，浙江 温州 325006)

【研究意义】植物在生长过程中会受到各种非生物胁迫因素的影响[1-2]。在长期的自然选择中，植物进化出了一套生长调节机制抵御这些不利因素的影响[3-6]。作为主要的非生物胁迫因素之一，渍水胁迫在多雨地区或季节会对植物生长和抗病产生不利影响，甚至会对农业生产造成严重损失。因此，研究植物渍水胁迫相关基因及其在植物抗渍水胁迫过程中的分子调控机制，对于植物抗渍水胁迫品种的选育改良有重要意义。青花菜属十字花科芸薹属[7]，不耐涝，淹水数天后其根系就会死掉[8]。浙江沿海一带是青花菜的主要产区之一，每年栽培期间易受台风、暴雨等侵袭，给青花菜生产带来严重损失[9]。Whirly转录因子在植物抗病信号转导途径、维持端粒长度、维护细胞器基因组稳定性等方面都发挥着重要功能[10-12]。因此，克隆青花菜Whirly转录因子，对进一步研究其渍水胁迫响应及其生物学功能具有重要意义。【前人研究进展】第1个Whirly家族成员是从马铃薯中分离出来的，其以单链形式与诱导应答元件ERE结合，通过调控Pr-10a基因来调节抗病信号传导途径[13]。后续又在三明野生蕉[14]、杧果[15]、土豆[16]、木薯[17]、辣椒[18]、黄瓜[19]等多种园艺作物中鉴定到该基因家族成员。在植物逆境响应中，Whirly蛋白质可与诱导应答元件结合调节相关基因的表达[19]。Whirly1可调节发育衰老过程中水杨酸的稳态[20-21]。Atwhy1拟南芥突变体对SA诱导的敏感性增加，表明其是该信号途径中的重要调控因子。沉默水稻OsWhirly基因可增强超敏反应[22]，表明其可能是该反应的负调控因子[23]。Whirly基因同样在维持植物细胞器稳定中发挥重要作用。玉米中ZmWHY1基因产生的ZmWHY1蛋白能与CRS1蛋白形成结合蛋白，促进叶绿体atp内含子的剪切。Whirly基因还被认为与胚胎发育和种子萌发有关。例如在Emb16玉米胚乳缺陷突变体中发现其胚胎发育停滞，胚乳会继续发育成大胚乳，其原因是Whirly基因突变[21]。【本研究切入点】虽然在一些有代表性植物如水稻、拟南芥、玉米等深入探讨了Whirly基因的部分功能，但大多数植物中Whirly基因的具体功能尚不清楚，特别是在青花菜等甘蓝类蔬菜中。目前关于青花菜Whirly基因在渍水胁迫下的作用机理还不清晰透彻。本试验克隆得到青花菜Whirly基因，分别命名为BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3，并利用生物信息学方法预测获得Whirly基因的理化性质参数、二级结构等，分析青花菜Whirly基因的进化关系及在渍水胁迫中不同时期的基因相对表达量。【拟决解的关键问题】本研究通过克隆青花菜Whirly基因，并对其序列特征、系统进化以及渍水胁迫下的表达特征等进行分析，为进一步深入研究其渍水胁迫响应及其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以青花菜自交系“KU20-7”为试验材料，常规育苗。5叶期时进行渍水胁迫处理，处理时间为0、2和6 d，每个处理设3次生物学重复。

1.2 青花菜Whirly基因的克隆

提取叶片总RNA后反转录成cDNA。参照本实验室青花菜转录组unigene库中Whirly基因的序列，设计引物(表1)。RT-PCR反应体系和程序参照裴徐梨等[24]的方法进行。对PCR扩增的特异条带进行克隆测序。

表1 青花菜Whirly基因克隆的引物序列

1.3 青花菜Whirly基因序列特性分析

利用ExPASy proteomice Sever预测青花菜Whirly蛋白的氨基酸分子量和等电点。利用SOSUI工具预测青花菜Whirly蛋白氨基酸序列的跨膜结构。

1.4 Whirly蛋白系统发育树的构建

利用软件MEGA 6.0对青花菜、甘蓝、拟南芥、江南卷柏、挪威云杉、无油樟等物种的Whirly氨基酸序列进行多重比对，而后构建系统发育树。

1.5 青花菜Whirly基因在渍水胁迫下的表达特征分析

以青花菜actin为内参基因，检测青花菜Whirly基因在渍水胁迫下的表达特征。青花菜Whirly基因的荧光定量引物序列见表2。qRT-PCR反应体系和程序参照裴徐梨等[24]的方法进行。

表2 青花菜Whirly基因qRT-PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 青花菜Whirly基因的克隆

RT-PCR扩增到3个特异条带(图1)，测序结果表明3个特异性条带均为Whirly基因家族成员，将其命名为BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3。3个基因的长度分别为795、723和783 bp，分别推导编码264、240和260个氨基酸(图2)。

M：DL 2000 marker；1～3：目的片段M：DL 2000 marker；1-3：Target fragment图1 青花菜Whirly 基因PCR扩增Fig.1 PCR amplification of Whirly gene in broccoli

下划线：引物序列Underlines: Primer sequences图2 青花菜Whirly 基因序列比对Fig.2 Sequence alignment of Whirly gene in broccoli

2.2 青花菜Whirly基因家族成员序列特性分析

BoWHY1理论等电点(pI)为9.18，相对分子质量为28.81 kD，包含1个长度为23 aa的跨膜螺旋(RAEFTVLVSAFNFVLPYLIGWHA)。BoWHY2的理论等电点(pI)为9.48；相对分子质量为26.22 kD，为可溶性蛋白。BoWHY3的理论等电点(pI)为9.58；相对分子质量为28.63 kD，包含1个跨膜螺旋(TKAEFAVLISAFNFILPHLIGWQ)，长度为23 aa。

2.3 Whirly蛋白系统发育树的构建

系统进化树结果表明，藻类、苔藓、裸子等低等植物位于进化树的底端，被子植物则聚为1个大组。被子植物又可分为2个亚组，第1个亚组包含16个Whirly家族成员，其中乌油樟、葡萄、杨树和木瓜相对独立，高等植物(拟南芥、萝卜、白菜、甘蓝和青花菜)则聚在一起。十字花科的Whirly基因成员又可细分为2个大分支，青花菜BoWHY1和BoWHY3则位于不同的小分支中。被子植物第2个亚组包含9个Whirly成员，聚类情况和第一亚组基本相同。青花菜BoWHY2位于本亚组中，表明其与BoWHY1和BoWHY3的亲缘关系相对较远(图3)。

图3 青花菜Whirly 基因家族的系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Whirly gene family in broccoli

2.4 青花菜Whirly基因在渍水胁迫下的表达特征分析

荧光定量PCR技术检测结果显示，BoWHY1的表达量随胁迫时间的延长其表达量逐渐下降。BoWHY2在渍水胁迫2 d时表达上升，表达量为对照的3.21倍，在渍水胁迫6 d时下降，表达量约为对照的1/5。BoWHY3在处理2 d时的表达量为1.42，6 d时的表达量为0.26，呈现出先上升后下降趋势(图4)。

图4 青花菜Whirly 基因在渍水胁迫下的表达特征Fig.4 Expression profile of Whirly gene under waterlogging stress in broccoli

3 讨 论

本研究从青花菜中克隆获得3个Whirly基因家族成员，分别命名为BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3。考虑部分近缘物种的基因数量，本研究认为已经基本上获得了所有的青花菜Whirly基因。其中BoWHY1与BoWHY3推导的氨基酸序列其氨基酸的个数相似，均包含1个长度相等、结构相似的二级结构跨膜螺旋。而BoWHY2推导的氨基酸序列在组成其氨基酸的个数、蛋白质的二级结构和蛋白质等电点等方面与另外两者之间存在差异。表明从序列特性的角度来看，BoWHY1与BoWHY3的相似度比BoWHY2更高。利用生物信息学的方法，分别从甘蓝、白菜、拟南芥、萝卜等物种中鉴定出4、3、3和3个Whirly基因[25-26]。

系统进化的分析结果显示，青花菜BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3同被子植物的Whirly成员位于同一大的分支上，其中BoWHY1和BoWHY3位于同一亚组中，而BoWHY2位于另一亚组中，因此笔者推测BoWHY1和BoWHY3属于旁系同源基因。另外藻类、苔藓、裸子等低等植物的Whirly在进化树上自成一个分支并位于进化树的底端，推测植物Whirly基因可能由一个祖先基因进化而来。这个祖先基因在藻类[27]、苔藓、蕨类植物中基本上未进行扩张，大多植物仅保留1个拷贝，甚至在个别物种中该基因消失。而到被子植物时该基因则开始扩张，变为2个拷贝，伴随着物种的进化以及多倍化过程的进行，不同的物种Whirly基因的数量则变得不同[16-18]。相对于其他一些成员较多的基因家族，Whirly基因的进化模式是比较简单的[28-30]。

高等植物的多倍化使其产生很多的旁系同源基因[31-34]，在进化的过程中，这些旁系同源基因会发生功能上的改变[35]。本试验通过qRT-PCR检测了青花菜Whirly基因在渍水胁迫下的表达特征，其表达特征差异明显，其中BoWHY2的相对表达量在渍水处理2 d达到最大值，是前期的3.21倍。作为旁系同源基因的BoWHY1和BoWHY3，二者在渍水胁迫下的表达特征差异明显。BoWHY1的表达量随胁迫时间的延长其表达量逐渐下降，而BoWHY3则呈先上升后下降趋势，表明其对渍水胁迫的响应机制可能存在较大不同。产生这种现象的原因就在于长期进化的过程中旁系同源基因BoWHY1和BoWHY3可能发生了亚功能化。

4 结 论

本研究克隆了3个青花菜Whirly基因。序列特征分析表明，BoWHY1与BoWHY3的亲缘关系相似度比BoWHY2更高。系统进化分析发现藻类、苔藓和裸子植物Whirly成员位于进化树的底端，高等植物Whirly成员则聚在一起，且BoWHY1和BoWHY3具有更近的亲缘关系。qRT-PCR分析结果显示，BoWHY1、BoWHY2和BoWHY3在渍水胁迫下展现出不同的表达模式。