蓝莓LFY基因表达量与内源激素的动态变化关系

苏泽春，和加卫，杨正松，杨雅涵，和志娇，和文佳

(云南省农业科学院高山经济植物研究所，云南 丽江 674199)

【研究意义】蓝莓为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(VacciniumL.)植物[1]，它是世界各国公认的营养保健水果，已研究探明其具有多种功能性成分，如对眼健康[2]、改善心血管机能[3]、抑制脂肪细胞分化[4]、抗炎症[5]、糖尿病[6]、有效地诱导癌细胞凋亡[7]、有益于儿童认知能力的提高等[8]。因此，蓝莓种植热和消费热已逐渐席卷全国，但蓝莓应季水果主要集中在5月前后上市，其它月份能否实现蓝莓应季上市是农业科研工作者普遍关注的科学问题。在商业生产中，北高丛蓝莓通常应用于温带，南高丛蓝莓应用于热带和亚热带，而矮丛蓝莓则应用于寒带[9]。有学者发现蓝莓种植在云南低纬度高海拔区域条件下，一些品种会出现双季开花结果的特征[10]，这一发现给蓝莓错季上市带来契机。【前人研究进展】国内诸多的蓝莓产区中，品种夏普蓝的关注度比较高，在种植过程中多个产区已发现该品种有一年多次成花现象。有学者在哥伦比亚研究过夏普蓝和比洛克西的丰产性，结果表明夏普蓝结实性更强，36月龄植株的累积产量比比洛克西高60%[11]；有学者在美国佛罗里达州西南部采用夏普蓝与其它品种搭配种植，研究结果表明，在冬季温暖的气候条件下搭配种植模式可实现无休眠蓝莓生产[12]，同时，乙烯利可延缓夏普蓝开花以应对美国东南部春季低温冻害[13]；夏普蓝引种到中国后，浙江、安徽、云南等省均发现该品种二次或多次成花现象[14-16]；蓝莓多次成花的理化研究及分子生物学研究在国内还未见报道，一些模式植物，如拟南芥中的LFY基因转到杨树中，超量表达可使7年以上才能开花的杨树在5个月内开花[17]；植物内源激素作为成花的生理信号对植物成花诱导、花芽分化等具有重要影响[18]。可见，将LFY基因表达量与内源激素的动态变化关系相结合，可为有效探索夏普蓝一年多次开花结果提供新途径。【本研究切入点】本研究尝试将T-PCR技术下获得的LFY基因时空表达与内源激素含量的动态变化相结合，将夏普蓝一年多次开花机理的研究引向深入。【拟解决的关键问题】研究试图通过观测夏普蓝一整年的LFY基因的表达量和内源激素含量之间的动态变化关系，以期揭示不同时期内源激素含量变化与成花基因之间的内在联系，为阐明夏普蓝多次成花的原因提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

蓝莓夏普蓝样品采集于云南省大理市银桥镇鹤下村云南省农业科学院高山经济植物研究所大理试验基地，地处100.12°E，25.76°N，海拔2014 m，以低纬高原季风气候为主，四季温差变化不大，干湿分明，年平均气温16.20 ℃，小于7 ℃的低温280 h，年降雨量800 mm，pH 4.96，土壤有机质含量58.69%。

1.2 试验方法

1.2.1 蓝莓成花基因的克隆与表达 取5年生夏普蓝的花芽，取样后立刻放入液氮中保存，随后置于-80 ℃冰箱中保存备用。从2018年4—11月进行取样，原则上每间隔7 d取1次样，取样过程中视花芽的生长发育情况存在小幅度的调整。

LFY同源基因的克隆与表达分析是通过GenBank数据库中检索近源植物LFY同源基因序列，使用DNAMNA软件进行序列比对分析，结合软件 Primer Premier 5.0，在比对结果的同源区设计的定量引物序列: YG-S(GTATTGCCAAGGAGCGAGGTGAA)和YG-A(GTTGGTCACAGTCAAATCACCCG)。选取蓝莓的RH8基因为内参基因，引物序列为RH8-S(GGTGAATCGAGTAGAACTGCTGGC)和RH 8-A(AGATTCCTGCATGCACCATTCCGA)。

蓝莓LFY同源基因的克隆与表达：参照叶阳阳[19]的方法进行。对不同分化时期的蓝莓花芽中LFY基因的表达量进行比较分析，明确在花芽分化的不同时期LFY基因表达量的变化。

1.2.2 内源激素含量的测定 2018年5月至2019年7月，选择生长正常且树势基本一致的植株作为采样植株，生长期在树羽冠中上部采集腋芽作为内源激素分析用的样品；休眠期采集结果枝顶部芽体；开春芽体萌动后，采集结果枝不同部位的芽体。3 次重复，每次各取芽体30个以上，样品均为混合样品。原则上每间隔15 d取1次样，取样过程中视芽的生长发育情况存在小幅度的调整。将擦拭干净的样品立即放入冰盒中带回试验室，分类置入-80 ℃液氮中速冻保存。内源激素测试样品液氮低温保存后，送到上海中科新生命生物科技有限公司进行检测，采用质谱多反应监测(Multiple reaction monitoring, MRM)技术结合UHPLC-MS/MS方法进行检测。

1.3 数据统计与分析

蓝莓成花基因克隆表达量及内源激素含量采用Excel软件作图，内源激素含量的差异性分析采用软件SPSS 23.0进行。

2 结果与分析

2.1 LFY基因的表达量与内源激素ABA的动态变化

结合不同生长发育时期夏普蓝成花基因克隆表达量、ABA内源激素含量及内源激素多重比较分析结果可以看出(图1)，LFY基因在2018年4月27日、2018年6月2—5日、2018年8月7日、2018年9月7—18日、2018年11月1日分别出现表达峰值，在两两峰值之间都对应发生了ABA内源激素的峰值，如2018年4月27日与2018年6月2—5日，ABA在5月20日出现峰值(405.25 ng/g)；2018年6月2—5日与2018年8月7日，ABA在7月4日出现峰值(489.81 ng/g)；2018年8月7日与2018年9月7—18日，ABA在8月20日出现峰值(509.09 ng/g)；2018年9月7—18日与2018年11月1日，ABA在10月20日出现峰值(890.01 ng/g)。从2018年11月之后的ABA变化趋势可以看出， 11月至翌年的4月中的 3月20日，ABA含量也出现1次峰值(425.71 ng/g)，正好出现在第1次LFY基因表达峰值前(4月27日)。从ABA含量的多重比较结果可以看出，峰值出现的时间节点中，3月20日与5月20日的差异不显著、7月4日与8月20日的差异也不显著。从夏普蓝成花基因克隆表达量与ABA内源激素含量的动态变化规律还可以看出，促成成花基因克隆表达量峰值的发生，ABA浓度几乎都处于400 ng/g以上的浓度值，全年中，夏普蓝中的ABA在11月下旬至翌年3月上旬处于较低浓度范围内，这一发现可为深入探索夏普蓝一年多次开花提供数据上支撑。

图1 LFY基因的表达量和内源激素ABA的动态变化Fig.1 Dynamic changes of LFY gene expression and endogenous hormone ABA

2.2 LFY基因的表达量与内源激素IAA的动态变化

从图2可以看出，在第2次与第3次LFY基因峰值之间，IAA含量从2018年5月4日的2.18 ng/g逐渐递增到2018年6月20日的5.43 ng/g，然后急剧下滑至2018年7月4日的0.95 ng/g，在2018年7月20日出现了LFY基因峰值发生期间的第2次较高浓度值(8.66 ng/g)；后面3次LFY基因峰值发生期间，IAA含量呈先升后降的抛物线态势，从2018年8月4日持续至2018年11月20日，浓度最低为2018年8月4日(0.74 ng/g)，最高为2018年10月20日(2.33 ng/g)；整体而言，前2次的IAA含量明显比第3次的高。持续对IAA含量进行检测后发现，2018年12月20日、2019年3月20日的IAA含量又呈现出波峰，由此可见，LFY基因表达量与IAA含量的联系不密切。

图2 LFY基因的表达量和内源激素IAA的动态变化Fig.2 Dynamic changes of LFY gene expression and endogenous hormone IAA

比较不同生长发育时期内源激素IAA含量可以看出，2018年7月4日(0.95 ng/g)、2018年11月20日(0.74 ng/g)、2019年1月20日(1.4 ng/g)是IAA处于波谷的3个时间节点，它们之间的IAA含量差异均不显著。2018年7月4日、2018年11月20日、2019年1月20日的波谷出现后，IAA含量迅速提升至2018年7月20日的8.66 ng/g、2018年12月20日的6.06 ng/g、2019年3月20日的6.34 ng/g的波峰。从分析结果可以看出，2018年7月20日的IAA含量显著高于2018年12月20日和2019年3月20日，2018年12月20日与2019年3月20日之间差异不显著。

2.3 LFY基因的表达量与内源激素ACC的动态变化

从图3可以看出，LFY基因峰值发生期间，以2018年8月20日为界点，前端的乙烯代谢前体ACC的波动折线犹如以该界点为圆点，顺时针旋转了180°后能与后端的波动折线相重合一般。界点前，乙烯代谢前体ACC两次波峰发生的时间分别为2018年5月20日(75.85 ng/g)、2018年8月4日(67.38 ng/g)，随着ACC波峰的发生，LFY成花基因对应出现2次表达峰值，时间分别为2018年6月2日和2018年8月7日。界点后，乙烯代谢前体ACC两次波谷发生的时间分别为2018年9月4日(38.76 ng/g)、2018年10月20日(33.11 ng/g)，随着ACC波谷的出现，LFY成花基因也对应出现2次表达峰值，时间分别为2018年9月7日和2018年11月1日。LFY基因峰值发生之外的时间范围内，乙烯代谢前体的ACC含量出现2次峰值，时间分别为2018年12月4日(70.22 ng/g)、2019年1月4日(75.65 ng/g)。

图3 LFY基因的表达量和内源激素ACC的动态变化Fig.3 Dynamic changes of LFY gene expression and endogenous hormone ACC

比较不同生长发育时期内源激素ACC含量可以看出， 2018年5月20日、2018年8月4日、2018年12月4日、2019年1月4日为ACC波峰出现时间，它们之间的ACC含量差异不显著；界点(2018年8月20日)后，2018年9月4日、2018年10月20日为ACC波谷出现时间，二者间的ACC含量差异也不显著。

2.3 LFY基因的表达量与内源激素CTK的动态变化

从图4可以看出，LFY基因峰值发生期间，内源激素CTK含量在2018年8月4日出现最大峰值，浓度为35.68 ng/g，在2018年6月20日和2018年9月4日也出现1次小的峰值，浓度分别为16.06和13.46 ng/g；2018年6月20日前，CTK含量呈缓慢上升趋势；2018年9月4日后，CTK含量呈缓慢下降趋势。LFY基因峰值发生之外的时间范围内，CTK含量总体上也维持在较低的浓度水平。

图4 LFY基因的表达量和内源激素CTK的动态变化Fig.4 Dynamic changes of LFY gene expression and endogenous hormone CTK

比较不同生长发育时期内源激素CTK含量可以看出，2018年6月20日前，2018年5月4日与2018年5月20日、2018年6月4日与2018年6月20日差异不显著，其余时间点差异显著；2018年9月4日至2018年12月20日，所有的CTK含量差异均不显著；其余时间点存在不同程度的差异。

2.4 LFY基因的表达量与内源激素GAs的动态变化

从图5可以看出，在LFY基因峰值发生期间，GAs含量从2018年5月4日的较低浓度值(1.98 ng/g)一直递增到2018年6月20日的第1次峰值(8.06 ng/g)，然后急剧下滑至2018年7月4日的谷底(3.99 ng/g)，接着在2018年7月20日出现了第2次高浓度值(8.41 ng/g)，随后一直到2018年11月4日，GAs一直处于较低的浓度水平。2018年11月20日GAs含量有所回升，浓度为3.74 ng/g，接着又下降至2019年1月4日(2.47 ng/g)才开始逐渐增加。

图5 LFY基因的表达量和内源激素GAs的动态变化Fig.5 Dynamic changes of LFY gene expression and endogenous hormone GAs

比较不同生长发育时期内源激素GAs含量可以看出，在LFY基因峰值发生期间，第1次峰值前(2018年6月20日)的2018年5月4日、2018年5月20日、2018年6月4日、2018年6月20日的浓度值，两两差异达到显著水平；第1次峰值(2018年6月20日)与第2次峰值(2018年8月4日)的2018年7月4日、2018年7月20日、2018年8月4日的浓度值，两两差异达到显著水平；第2次峰值(2018年8月4日)至2018年11月4日的GAs含量，两两差异也达到显著水平。在LFY基因峰值发生之外的时间范围内，2018年11月20日至2019年1月20日，除2018年11月20日与2018年12月4日、2018年12月20日与2019年1月4日差异不显著外，其余时间节点的GAs含量均达到显著水平。

3 讨 论

果树二次开花通常被认为是不正常的生理现象，会致使来年产量和质量的降低[20]。由于蓝莓是多年生小灌木，每年新长的萌蘖枝都能培养成结果枝，因此，蓝莓二次开花对生产的利与弊应结合品种特性与种植环境来定。蓝莓原产于北美，理论上属于低温成花植物[21]，而一些品种适应云南的特殊环境后，没有低温条件也能开花，甚至有二次或多次开花的特征[22]，表现为春花果结果枝为头一年8—10 月的秋梢、夏花果为当年的春梢、秋花果为当年的夏梢。有学者在浙江对3个蓝莓品种作了内源激素和StLFY基因表达等方面的研究[23]，由于只开1次花，又只在花期取样，只探明了简单的规律性，无法为多次成花机理提供充足的理论依据。由于品种特性的不同，多数品种两次开花之间不会存在时间的重叠，而夏普蓝却存在时间的重叠，说明该品种的成花机理非常特殊，所表现的一些生理现象也会与其它品种有所不同。

ABA是一种重要的植物生长调节剂，能参与多种生理调控和多种非生物胁迫应答。目前，ABA在蓝莓生理调控方面只有零星报道，但结论依然存在争议，有学者认为花芽分化过程中，ABA呈降—升—降的变化趋势，并提出花芽分化末期ABA值最大[24]；而有学者认为低浓度ABA更容易使奥尼尔、梯芙蓝、园蓝成花[23]。本研究结果表明，ABA积累到一个峰值后，随着浓度的变小刺激了LFY基因的表达；整体而言，LFY基因峰值发生期间，ABA含量都普遍高于发生之外，说明较低浓度的ABA含量也具有诱导花芽休眠、抑制成花的作用，这一观点与李广等[25]对侧柏的研究一致。

生长素是第一个被发现的植物激素，在植物生长过程中主要的作用是促进细胞的伸长生长。目前，蓝莓生长素的研究大多侧重于外源激素对种苗生根等的影响，在生理调控方面，生长素对花芽分化的作用尚无统一定论，付传明等[26]认为芽中低水平的IAA 有利于花芽分化，梁钒等[27]却认为高水平IAA 有利于花芽分化。本研究中，LFY基因峰值发生期间，IAA在2018年6月20日和2018年7月20日出现两次波峰，其余时段却处于较低的浓度值；LFY基因峰值发生之外的时间范围内，IAA在2018年12月20日和2019年3月20日也出现两次波峰。结合5次LFY基因表达量峰值出现时间，本研究认为，2018年6月20日和2018年7月20日出现两次波峰与花芽分化的联系并不紧密，这一时期是蓝莓抽梢及新根发生的关键时期，但是否与之相关还需进一步研究才能定论。王海波等[28]研究葡萄表明，IAA具有叶片衰老前期促进叶片生长发育、叶片衰老后期加速衰老的双重作用，本研究IAA 后两次波峰出现是否也存在双重作用也需进一步开展研究。

乙烯的基本生理功能是解除种子休眠、促使果实成熟和调节植物衰老，因此，植物在多个生长发育阶段所需的乙烯较少。大量研究已证实，乙烯可调控花性别和授粉过程。对于瓜类而言，乙烯被认为是黄瓜的“性激素”，主要是促进雌花发育[29]。本研究中，LFY基因峰值发生期间, 乙烯代谢前体ACC的波动折线犹如以2018年8月20日为界点，前端的波动折线顺时针旋转了180°后几乎能与后端的波动折线相重合，但无论前端还是后端，都有LFY基因表达量峰值的发生。前端对应的ACC浓度值相对较高，后端ACC浓度值相对较低。前端，果园内搭配的双丰、蓝丰、比罗西、红粉佳人等授粉树品种不定期开花，后端，果园内只有夏普蓝独自开花，有无花粉会刺激夏普蓝作出性别分化上的表达，这方面的信号传导途径已有详细的报告，说明前端的乙烯代谢前体ACC含量维持较高浓度时有利于花芽分化朝雌性化方向表达；后端的乙烯代谢前体ACC浓度相对较低有利于花芽分化朝雄性化方向表达。

细胞分裂素主要的作用是促进细胞分裂，主要存在于可进行细胞分裂的部位。多数学者认为细胞分裂素(CTK)有促进细胞分裂、芽的分化、除顶端优势等作用。从表观角度来看，夏普蓝开花与结果之间不存在明显的界线，但每次开花结果的部位不相同，春花果结果枝为头一年8—10 月的秋梢、夏花果为当年的春梢、秋花果为当年的夏梢，本研究中，4月4日出现的高浓度CTK是春梢上分化花芽并结夏花果的关键；6月20出现的高浓度CTK是夏梢上分化花芽并结秋花果的关键；9月4日出现的高浓度CTK是秋梢上分化花芽并结春花果的关键。

赤霉素是植物体内具有重要作用的一类激素，其作用主要有促进节间伸长、花的诱导和种子萌发等。大量研究表明，赤霉素无论在长日照还是短日照条件下都能够诱导成花,对未经春化作用的植物和长日照植物诱导开花效果显著。研究还发现，GAs与IAA具有如协同促进果实发育茎的伸长等作用[30]。本研究中，夏普蓝也表现出一定的协同作用，LFY基因表达量的前2次峰值出现时伴有GAs和IAA浓度的提高，而LFY基因表达量的后3次峰值出现时，IAA和GAs却一直处于较低浓度水平，由此可见，8月中旬前，GAs与IAA含量的协同变化主要表现为协同促进茎的伸长和果实发育，8月中旬以后，主要表现为协同促进果实发育。

4 结 论

结合蓝莓LFY基因表达量与内源激素的动态变化进行分析后，发现LFY基因峰值发生期间, ABA峰值间或出现在每一次LFY基因峰值之前，随着ABA浓度由每个波峰走向波谷，都会刺激LFY基因量的表达；在第2次与第3次LFY基因峰值之间，IAA含量从2.18 ng/g递增到5.43 ng/g，然后急剧下滑到0.95 ng/g，又急速升至8.66 ng/g，其余时刻的IAA含量一致维持在较低水平，仅结合LFY基因表达量进行分析，生长素IAA对成花机理的作用机理尚不清晰；LFY基因峰值发生期间, 乙烯代谢前体ACC的波动折线犹如以2018年8月20日为界点，前端的波动折线顺时针旋转了180°后几乎能与后端的波动折线相重合。前端有较高浓度的ACC、后端有较低浓度的ACC，但都对应有LFY基因峰值的发生，不同浓度的ACC调控着花性别分化的发生；细胞分裂素CTK能促腋芽细胞分裂与伸长、促进芽分化为花芽，4月4日出现的高浓度CTK是春梢上分化花芽并结夏花果的关键；6月20出现的高浓度CTK是夏梢上分化花芽并结秋花果的关键；9月4日出现的高浓度CTK是秋梢上分化花芽并结春花果的关键；赤霉素在多场合下均表现为两两之间差异显著，高低间或发生变化，并与其它激素一起促进节间伸长和诱导成花。