具有固氮和耐酸特性甘蔗属野生割手密的筛选与鉴定

梁宏卫，Prakash Lakshmanan，刘晓燕，黄柯钧，颜 睿，罗 霆

(1.广西农业科学院甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业农村部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室，南宁 530007；2.广西博庆食品有限公司，广西 宜州 546300)

【研究意义】土壤酸化造成耕地养分损失而危害作物生长[1]，是全世界面临的最大农业环境问题之一[2]。广西是仅次于巴西圣保罗的世界第二大产糖省份，甘蔗栽培面积和蔗糖产量均占全国的60%以上，超过2600万农民(占广西农业人口的50%以上)从事甘蔗生产，但广西约8×105hm2甘蔗种植在pH低于5.0的酸性土壤中[3]，而大量偏施氮肥是广西蔗地土壤酸化的最主要原因[4-5]。广西蔗地年施氮量为500～755 kg/hm2，是巴西的6～10倍，超世界平均施氮水平3倍以上，造成生产成本高、土壤酸化和环境污染，引发甘蔗产量和品质下降、固氮效率低及大面积宿根黄化等问题[6-8]。割手密(SaccharumspontaneumL.)又称甘蔗属细茎野生种，国内外现代甘蔗品种的亲本除少部分含有个别大茎野生种、中国种或印度种的血缘外，其余绝大多数均为割手密和热带种原种的后代。割手密变异类型多、遗传多样性丰富[9-10]、适应性广、抗逆性强、对各种土壤类型具有很强的适应性，甚至能生长在氮含量接近零的成土母质或石缝中[11]，从中发掘兼具固氮和耐酸特性的变异类型用于甘蔗育种，不但能填补甘蔗耐酸种质资源发掘研究的空白，还有望实现减少氮肥施用、缓解土壤酸化进程和获得固氮且耐酸的甘蔗种质资源。但目前甘蔗及其近缘属的耐酸种质资源发掘利用滞后，对割手密耐酸机制也一无所知。因此，评价和鉴定中国甘蔗种质资源圃广西分圃前期研究获得的部分甘蔗属野生割手密种质资源的农艺性状、固氮能力和耐酸特性，对我国甘蔗属野生割手密种质资源的创新及固氮且耐酸品种选育具有重要意义。【前人研究进展】20世纪60年代巴西研究人员从甘蔗根际分离得到多种固氮菌并开创非豆科植物联合固氮研究[12]，80年代末又从甘蔗体内分离得到几种固氮菌，将内生固氮菌概念引入非豆科植物联合固氮领域[13]。Döbereiner实验室研究证实，巴西甘蔗品种能通过联合固氮获得生长所需氮素的30%～70%[14-15]，部分常年不施氮肥甘蔗品种的固氮效率甚至达85%[16]，而我国甘蔗品种联合固氮效率相对较低，约为5%[17]，但在严格低氮和接种高效固氮菌条件下固氮效率能得到进一步提高[17-18]。已有研究认为，巴西甘蔗高效联合固氮系统的形成与长期不施或少施氮肥有关，缺氮使得巴西甘蔗体内固氮能力强的细菌受到选择而长期存活，并稳定地与寄主联合固氮，使寄主逐渐被驯化成高固氮甘蔗品种[19-20]。可见，发掘甘蔗的固氮潜力能有效减少氮肥施用，但我国现有的甘蔗栽培品种由于长期处于高氮胁迫下，甘蔗体内能低氮存活的细菌数量仅相当于巴西品种的最低水平(104CFU/g DW)，很难形成高效联合固氮系统，不能作为发掘、探寻甘蔗高效联合固氮机制和种质资源的理想分析群体。土壤酸害或盐碱毒害是限制作物生长与产量提高的主要非生物胁迫因子之一。Chen等[21]、Xue等[22]研究认为，在酸化土壤中，游离出来的铝、锰和氢等离子对植物产生毒害，使得钙、镁和磷等元素有效性降低，造成植物养分缺乏；植物应对酸性土壤胁迫的机制包括改变根际土壤pH降低铝和锰的毒性以提高养分吸收效率，通过将铝离子隔离在细胞液泡中隔绝其对细胞的伤害，以及通过根系分泌物将根际pH调整到有利于养分吸收范围以降低养分缺乏程度，促进植物生长。培育耐酸铝作物品种是有效利用酸性土壤、提高作物生产力的最根本和有效途径。目前，通过选育获得耐酸水稻、苜蓿、玉米、大麦和油茶等作物品种的研究已有报道[23-24]，也有研究证实MATE基因家族中的SbMATE基因对甘蔗耐酸(铝)发挥作用[23]。根尖是铝的作用位点和积累区，抑制根尖生长是铝毒害的最明显特征[25-26]。铝毒害能使根尖细胞分裂和伸长受阻、根冠生长缓慢、根尖变形、侧根减少、主根变短，使根中的有机酸、酚类物质和细胞壁相关多糖的产生、释放及细胞骨架发生变化，进而影响植株的生长发育[27-28]。海洋细菌N-LY-1菌株具有一定的固氮能力，其一定浓度无菌发酵液能促进黄瓜幼苗生长，具有进一步开发为农用微生物制剂的潜力。【本研究切入点】通过育种手段改良甘蔗品种，使其耐酸和固氮，可能是解决氮肥过量施用和土壤酸化影响甘蔗产量和品质的最有效途径，但迄今鲜见甘蔗耐酸基因资源发掘利用及通过评价鉴定甘蔗属野生割手密种质资源农艺性状和固氮能力筛选兼具固氮和耐酸特性甘蔗特异种质的研究报道。【拟解决的关键问题】利用设立于广西南宁市的中国甘蔗种质资源圃广西分圃前期研究获得的部分甘蔗属野生割手密核心种质，进行农艺性状、固氮酶活性及不同酸水平下的根重和根系活性变化情况分析，评价其固氮和耐酸能力，以期获得兼具固氮和耐酸特性的割手密材料，为发掘我国甘蔗耐酸性品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试33份割手密材料由中国甘蔗种质资源圃广西分圃(南宁)保存提供，是该圃在前期研究中从2000余份割手密材料中筛选获得的核心种质。

1.2 试验方法

1.2.1 外观农艺性状和固氮特性分析与鉴定 将参试割手密材料以10 cm长的单芽截茎栽培于30 L容量、装有v(沙)∶v(蛭石)=1∶1基质的胶桶中，每桶种2芽，每个品种种5个重复(桶)。桶中基质pH 5.61，全氮98.0 mg/kg，全磷169.0 mg/kg，全钾360.0 mg/kg，有机质1.4 g/kg。试验材料于2020年3月11日种植，当年11月调查农艺性状和进行固氮特性分析。株高为从地面测量到第一片可见肥厚带叶鞘处的高度；茎径为以游标卡尺测量主茎中位节间中部的直径，测量时游标卡尺的方向与节上芽点方向平行；锤度为茎基部节间的测量值；干物率测定采用烘干法，取新鲜+1叶(第一片可见肥厚带叶片)剪碎，80 ℃烘干至恒重，计算干物率；参考罗霆[7]的方法进行固氮酶活性测定和nifH基因克隆；分析所调查农艺性状和生理指标的变异情况及其相关性，并对其进行欧氏距离聚类。同时，按高、中、低对农艺性状进行分级(表1)，综合评价割手密种质的农艺性状和固氮酶活性，筛选出农艺性状优良的固氮割手密材料。

表1 割手密种质的主要性状分级标准

1.2.2 耐酸特性鉴定 于2021年3月，将筛选得到的优良固氮材料水培于半自动循环水培系统，每份材料种植8株，全生育期培养于Hoagland营养液[成分为KNO32.5276 g，Ca(NO3)2·4H2O 5.9038 g，K2SO40.4360 g，MgSO4·7H2O 2.4600 g，ZnSO4·7H2O 0.1099 mg，CuSO4·5H2O 0.3930 mg，KH2PO468.0420 mg，MnCl2·4H2O 0.9050 mg，H3PO31.4300 mg，Fe-EDTA 0.3000 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.0100 mg]。利用HCl将水培液的pH分别调至6.0和3.0，当年11月测定根系重量和根系活力。称重根系时先将植株从水培系统取出，将根系与植株分离，用棉布擦干表面水分；根系活力测定采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)。

综合分析农艺性状、固氮酶活性(还原乙烯量，以乙炔还原反应中产生的乙烯含量计，下同)和酸性条件下的根重和根系活力等，筛选出兼具固氮和耐酸特性的种质。

1.3 统计分析

利用Excel 2016记录和整理数据，以SPSS 22.0进行相关分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 各割手密材料的农艺性状变异情况及等级划分

由表2可知，33份割手密种质株高、总茎数、锤度、干物率和固氮酶活性的变异系数分别为18.00%～111.00%、22.00%～147.00%、21.00%～145.00%、58.00%～75.00%和25.00%～1810.00%，平均值分别为31.73%、37.22%、40.69%、6.77%和59.22%，变异系数的平均值排序为固氮酶活性>锤度>总茎数>株高>干物率，其中，固氮酶活性变异系数的平均值最大，说明这些割手密材料中存在固氮能力变异丰富的不同类型，参试割手密材料的固氮能力差异明显，而干物率变异系数的平均值最小，实际干物率变化范围在0.54%～0.68%(表3)，说明参试割手密材料的干物率遗传变异不明显。

表2 割手密种质主要性状的变异情况

表3 割手密种质主要性状的分级

续表3 Continued table 3

以5个性状指标对参试33份割手密材料进行Pearson相关分析，结果(表4)发现干物率与锤度、固氮酶活性与总茎数呈显著正相关(P<0.05，下同)，相关系数分别为0.469和0.489；干物率与总茎数呈显著负相关，相关系数为-0.381，其余性状间无显著相关性(P>0.05，下同)，说明株高、总茎数、锤度、干物率和固氮酶活性间相关性不强。

表4 割手密材料主要性状的相关系数

表3中，固氮等级为1的高固氮种质包括GSM627、GSM824、GSM1119、GSM1926、GSM111、GSM236、GSM226、GSM720、GSM20、GSM177、GSM03和GSM152，综合这12份种质的农艺性状表现，发现种质GSM177和GSM03的所有农艺性状指标分级均等于或高于2级，是综合性状优良的固氮割手密材料，对分离自种质GSM177和GSM03根系内的细菌进行固氮nifH基因克隆，结果(图1)证实种质GSM177和GSM03体内存在大量固氮细菌，进一步验证GSM177和GSM03是综合性状优良的固氮型割手密材料。

图1 种质GSM177(T1、T3、T4、T5、T9和T11)和GSM03(S2、S5、S7和S14)内生细菌的nifH固氮基因克隆Fig.1 Cloning of nitrogen-fixing nifH gene of endophytic bacteria in germplasm GSM177(T1，T3，T4，T5，T9 and T11) and GSM03(S2，S5，S7 and S14)

2.2 割手密种质的聚类分析

从图2可看出，根据农艺性状，参试的33份割手密种质在欧式距离10.63处可分为两大类，第一大类包括GSM103、GSM327、GSM414、GSM418、GSM516、GSM602、GSM515、GSM427、GSM1126、GSM824、GSM1119、GSM720、GSM19和GSM20共14份种质，其余19份种质(GSM24、GSM27、GSM3-5、GSM3-18、GSM421、GSM511、GSM627、GSM825、GSM1926、GSM126、GSM111、GSM236、GSM226、GSM717、GSM8、GSM11、GSM177、GSM03和GSM152)聚为第二大类；在欧式距离8.51处，第一大类和第二大类均可进一步分为2个类群(分别为第一至第四类群)，第一大类的第一类群包括GSM103、GSM327和GSM414共3份种质，其余11份种质聚在第二类群；第二大类的GSM627、GSM03、GSM111、GSM236、GSM177和GSM152共6份种质聚入第四类群，其余13份种质聚在第三类群；一些种质的聚类结果与种质本身特性具有一定的一致性，如聚在第四类群的6份种质为多茎的高固氮组合，其总茎数和固氮等级均为1级，在聚类图中也表现出较高的相似性，在第三类群中，GSM3-18、GSM825、GSM226和GSM1926聚为一个小类，这4份种质的株高和干物率均为3级，有植株矮小和干物率低的特点；种质分类特点与地理来源关系不明显，如来自云南、广东和广西的割手密种质虽地理来源相对较远，但很多种质因具有相似的农艺性状或固氮特性而聚在一起，而来源相同的种质却分散聚在不同类群(聚在第四类群的多茎高固氮种质GSM627、GSM03、GSM111、GSM236、GSM177和GSM152分别来源于云南蒙自、广西灵山、广西柳江、广东湛江、广西临桂和广西象州)，说明不同割手密种质不能根据地域来源明显聚类，但具有较多相同性状特征的种质可聚为一类。可见，割手密种质的表型和固氮能力在长期演化和自然选择过程中发生了显著变化。

图2 33份割手密种质根据农艺性状和固氮酶活性的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of 33 samples of S. spontaneum L. based on agronomic traits and nitrogen fixation activity

2.3 种质GSM177和GSM03在不同pH水平下的根重和根系活力比较

通过外观农艺性状和固氮特性分析，种质GSM177和GSM03是农艺性状优良的固氮割手密材料。利用不同pH水平对种质GSM177和GSM03进行耐酸性筛选和鉴定，发现种质GSM177在pH 3.0和pH 6.0下均表现植株高大、分蘖多、根系发达，外观农艺性状差异不明显(图3-A)，而种质GSM03在pH 6.0下植株高大、分蘖多、根系发达，在pH 3.0下植株矮小、根系短小、侧根少(图3-B)。从图4和图5可看出，种质GSM03的根重和根系活力在pH 3.0和pH 6.0下均存在极显著差异(P<0.01)，种质GSM177的根重和根系活力在pH 3.0和pH 6.0均无显著差异，进一步说明种质GSM177较耐受酸性土壤环境，其在pH 3.0和pH 6.0下生长发育差异不明显，而种质GSM03是典型的酸敏感型材料，在pH 3.0下其根系生长受到明显抑制，根系活力极显著降低，生长发育受阻，外观农艺性状发生明显改变。

图3 种质GSM177和GSM03在不同pH下的植株形态Fig.3 Morphology of GSM177 and GSM03 at different pH levels

不同种质图柱上不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，下同Different lowercase letters on the bar of different germplasms represented extremely significant difference(P<0.01)，the same as below图4 种质GSM177和GSM03在不同pH下的根重Fig.4 Root weight comparison of germplasm GSM177 and GSM03 at different pH levels

图5 种质GSM177和GSM03在不同pH下的根系活力Fig.5 Root activity comparison of germplasm GSM177 and GSM03 at different pH levels

3 讨 论

割手密是现代甘蔗品种十分重要的野生型原始种亲本，主要用于改良甘蔗新品种的抗性、适应性和产量。我国是割手密多样性分布中心之一，其种质资源类型丰富多样，在抗旱[29]、耐寒[30]，抗病[31]、耐高温[32]和耐铝毒[33]等方面均存在丰富的变异类型，在株高、茎数和锤度等重要农艺性状及叶片蜡质数量和叶片SPAD值等特殊性状中也具有丰富的变异。俞华先等[34]分析发现，68份云南割手密F2创新种质的变异系数为10.57%～35.30%。刘建乐等[35]研究揭示43份割手密种质资源的变异系数为9.87%～206.37%。说明割手密种质间差异明显，资源类型丰富，有利于特异种质材料的比较和筛选。本研究中，参试的33份割手密在干物率、株高、总茎数、锤度和固氮酶活性等性状的平均变异系数分别为31.73%、37.22%、40.69%、6.77%和59.22%，从中也得出割手密种质变异类型丰富的结论，其中固氮酶活性是变异最大的指标，说明这批割手密种质的固氮能力变异潜力较大。可见，具有丰富固氮变异类型的割手密种质群体很可能是发掘固氮基因资源的种质资源库，因此，在甘蔗固氮品种选育上应加大对割手密种质的利用力度。

俞华先等[34]对68份云南割手密F2创新种质进行聚类分析，在欧氏距离10.00处可将其划分为4个类群，同一类群种质的农艺性状特征相似。刘建乐等[35]通过聚类分析，将43份割手密种质分为3个类群，不同类群间遗传关系与地理来源无必然联系，割手密种质后代耐旱性强弱与其父本割手密的气候生态类型、地理位置和海拔无明显相关性。本研究结果与上述研究结果相似，在欧式距离为8.51处，可将参试割手密分为4个类群，其中，不同割手密材料未能根据地域来源明显聚类，但具有较多相同性状特征的种质却能聚在一起，说明割手密种质在自然选择中发生了大量基因迁移，使得不同地域来源的材料具有相似性状。刘新龙[36]对我国6个省9个地区的171份十倍体割手密种质进行聚类分析，结果表明，表型性状与采集地的地势具有一定关系，高地势的滇东北地区和滇西北地区聚为一个小类群，低地势的滇东南、滇西南、川东南和广东地区聚为一个大类群，本研究结果与其不一致。究其原因可能是割手密种质在长期自然选择中依不同地势发生了适应性进化，在相同海拔高度的割手密种质已进化出相似的农艺性状特征而聚在一起。

本研究中，在不同pH水平下，耐酸种质GSM177的根重和根系活力未受到pH的明显影响，而酸敏感种质GSM03在pH 3.0时的根重和根系活力极显著低于pH 6.0时，说明在pH 3.0下种质GSM03的根细胞分裂和伸长严重受阻[37]。

目前，在苜蓿、玉米、大麦和油料等作物中已获得耐酸(铝)转基因材料(品种)OsSTAR1/2、OsNrat1、OsFRDL4和OsALS1，MATE基因家族中的SbMATE、ZmMATE、VuMATE和AtMATE基因及ALMT基因家族的AtALMT1基因等也与植物耐酸(铝)有关[23-24]，但甘蔗上仅验证了MATE基因家族中的SbMATE基因对甘蔗耐铝发挥作用[23]。迄今，各国对甘蔗及其近缘属的耐酸基因资源发掘利用滞后，对割手密种质耐酸遗传机制仍一无所知，本研究团队后续将开展酸胁迫对种质GSM177形态、生理和分子水平影响的研究，为割手密种质耐酸基因的筛选、鉴定和表达提供形态、生理和遗传佐证。

4 结 论

33份割手密种质变异类型丰富，种质间的干物率与锤度、固氮酶活性与总茎数呈显著正相关，干物率与总茎数呈显著负相关，其余性状间无明显相关性；不同割手密种质未能根据地域来源明显聚类，但具有较多相同性状特征的种质能聚为一类。GSM177和GSM03是综合性状优良的固氮型割手密种质，其中，GSM03是典型的酸敏感型种质，而种质GSM177兼具固氮和耐酸特性，应加强其在甘蔗育种中的利用。