线粒体氧化应激相关分子在脑缺血再灌注损伤中作用的研究进展

杨雨鸣,王淑英

(1.佳木斯大学基础医学院; 2.黑龙江省微生物-免疫调节网络与相关疾病重点实验室,黑龙江 佳木斯 154007)

脑卒中因具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点，对人类生命健康造成严重威胁，更给社会和经济带来负担。缺血性脑卒中发病率高于出血性脑卒中，约占脑卒中病例的70%～80%[1]。缺血性脑卒中的治疗方法以血管内溶栓为主，通过药物应用溶解血栓，恢复局部脑区的血流供应。但是,溶栓对于时间窗和禁忌症具有较为严苛的限制，并且，血流灌注的恢复亦会造成脑区的二次损伤，即再灌注损伤[2]。脑缺血再灌注损伤的机制与氧化应激和能量供应不足密切相关。作为细胞的“能量中心”，线粒体在氧化应激和能量供应方面扮演重要角色。多种线粒体分子都与氧化应激有关，其中主要包括呼吸链复合物[3]、解偶联蛋白[4](uncoupling protein，UCP)以及去乙酰化酶[5](sirtuins，SIRTs)。近年来，通过药物调节线粒体氧化应激相关分子治疗脑缺血再灌注损伤的研究具有一定进展，对保护缺血再灌注损伤的神经元和改善病人愈后具有积极意义。

1 氧化应激与脑缺血再灌注损伤

氧化应激是指机体氧化剂和抗氧化剂之间的生理平衡状态受到破坏，而偏向于氧化的病理状态。氧化应激是多种疾病发生发展的重要机制，现有研究已经表明，氧化应激及其相关的分子事件与脑缺血再灌注损伤的病理进程密切相关[6]。脑缺血再灌注损伤发生时，损伤的组织内自由基和活性氧数量增加，同时具有保护作用的抗氧化剂水平下降，机体自主防御屏障受到破坏，神经元受到直接损伤。此外，作为诸多病理机制的起始环节，氧化应激与能量供应障碍、炎症反应、细胞自噬等病理机制相互关联，最终导致神经元以及脑组织的病理损伤[7]。

缺血性损伤发生后，受损伤脑区的血流量低于正常水平，而血红蛋白是氧气的重要载体，因此，相应区域氧分压降低，二氧化碳分压增高，导致组织酸中毒、能量供应障碍、氧化与抗氧化水平失衡，进一步损伤脑部血管微循环,加重氧化应激水平和脑组织脑损伤。另一方面,缺血再灌注损伤后，机体内水平升高的活性氧会作用于脂质、蛋白质和DNA成分，直接造成细胞损伤；此外,活性氧通过细胞间信号传导途径与其他病理机制建立连接，如免疫反应、自噬反应等，进而导致不同形式的细胞死亡[8]。

2 线粒体与脑缺血再灌注损伤

线粒体是参与细胞能量供应和离子水平调节的重要细胞器，而细胞内外离子水平的失衡也会激活活性氧和活性氮的大量产生，从而使细胞处于氧化应激状态。因此,线粒体自身稳定状态和功能平衡的维持在脑缺血再灌注损伤的发生和发展中具有重要作用[9]。

生理情况下,细胞内含量适当的活性氧对细胞正常功能的维持具有一定作用,并且,机体内抗氧化系统中的抗氧化酶和抗氧化剂可以清除活性氧，以维持氧化物质和抗氧化物质的动态平衡[10]。缺血再灌注损伤发生时，活性氧过量产生，破坏细胞膜结构，线粒体自身结构的稳定状态难以维系，功能随之受损，直接影响细胞能量供应，导致细胞死亡。另一方面,过量的活性氧也会影响细胞内的物质交换,进而间接造成细胞损伤。线粒体通透性转换孔是调节线粒体基质和细胞质间分子交换的结构,对维持线粒体内外物质平衡具有重要作用。亲环素D位于线粒体基质,是对线粒体通透性转换孔具有关键调节作用的组分之一,在神经元缺血性损伤过程中,这种调节作用尤为明显[11]。正常情况下,线粒体通透性转换孔对小分子代谢产物和部分离子有选择性通过作用。当细胞处于氧化应激状态时,能量供应障碍,离子通道对细胞内外电化学梯度的维持作用部分丧失,钙离子大量内流,线粒体通透性转换孔的选择透过性下降,大量离子和活性氧等小分子物质涌入胞内,造成线粒体损伤,同时促进线粒体内部分蛋白释放入胞质,激活Caspase 3,触发其相应级联效应,致使神经元死亡[12]。

3 线粒体氧化应激相关分子在脑缺血再灌注损伤中的作用

线粒体在能量供应障碍和氧化应激病理机制中具有关键作用,因此,调节氧化应激相关分子,有利于恢复缺血再灌注损伤的神经元线粒体功能,进而保护缺血再灌注损伤脑组织。在线粒体内部,分布有不少与线粒体功能密切相关的分子蛋白,它们或单独或协同作用,对线粒体稳态维持和功能发挥具有重要意义。其中,与氧化应激相关的线粒体分子主要包括：呼吸链复合物、解偶连蛋白和去乙酰化酶。

3.1 呼吸链复合物线粒体呼吸链复合物位于线粒体的内膜,以蛋白质复合体为主要存在形式,其功能主要是将电子从还原型辅酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)传递至辅酶Q,同时偶联四个质子并将其从线粒体基质泵出,转运至内外膜间隙,形成跨膜质子梯度,触发三磷酸腺苷(5’-Adenylate triphosphate，ATP)合成,为细胞供应能量[13]。脑缺血发生时,急性缺血缺氧直接引起的线粒体呼吸链功能障碍,导致细胞进入氧化应激状态,即使恢复灌注后,氧化应激仍持续存在,线粒体结构的稳定性受到破坏,给其功能稳态的维持带来不利影响,其内部抗氧化系统清除活性氧进程受阻,进而导致细胞死亡。就线粒体内部而言,呼吸链的功能异常亦会致使活性氧的产生,进而促进线粒体结构分裂,膜电位降低,均对神经元正常存活造成不利影响。左归丸是由六味地黄丸衍化而来,被证明具有抑制神经元凋亡、保护大脑功能的作用。余敏[14]等对慢性脑缺血大鼠应用左归丸进行治疗,结果发现,与模型组相比,接受左归丸治疗的大鼠脑组织中细胞呼吸链酶复合物活性较模型组明显提高,活性氧水平明显降低,线粒体功能得到显著改善。研究表明,左归丸可以通过提高线粒体呼吸链复合物的活性水平,改善线粒体功能,降低氧化应激水平,发挥对慢性缺血损伤脑组织的保护作用。细胞色素是线粒体呼吸链复合物Ⅲ和Ⅳ的组分之一,也是线粒体氧化磷酸化过程中的必经环节。银杏叶提取物预处理能够抑制线粒体细胞色素c的释放,进而抑制Caspase 3的裂解活性,从而减轻细胞凋亡,保护损伤脑组织[15]。药物通过作用于线粒体呼吸链复合物,调控细胞氧化磷酸化反应,干预氧化应激进程,进而有效对抗氧化应激,保护受损脑组织。呼吸链复合物参与完成生物氧化和氧化磷酸化的过程,同时具有丰富的抑制和激活位点,因此,不同药物或特定药物的不同成分对线粒体呼吸链复合物的作用有所差异,这也为缺血再灌注损伤药物的研发提供思路：即通过药物靶向作用于呼吸链复合物特定位点,或提升药物某些组分的比例，从而使药物在疾病治疗中发挥更大的功效。

3.2 解偶联蛋白UCP是位于线粒体内膜、参与将质子由线粒体内膜转运到基质的蛋白家族。UCP具有较高的质子转运活性,将质子直接转送至线粒体基质而不参与合成ATP,同时线粒体内膜两侧质子梯度降低,电子流动的驱动力降低,活性氧产生受到抑制。UCP1是最早被发现的解偶联蛋白,其主要存在于棕色脂肪组织中,与机体非战栗产热有关。随后的研究表明,UCP2具有较强的质子转运能力,其表达水平增加能降低质子穿过线粒体内膜的动力,从而减少活性氧的产生[16]。轻度解偶联能引起线粒体膜电位的降低,并降低活性氧的水平。在脑中,UCP表达广泛,其中以UCP2,UCP4和UCP5为主。UCP2,UCP4和UCP5在脑中的分布有一定差异。其中,UCP2主要表达于健康个体的皮层下神经元,在调节能量平衡、神经内分泌和自主神经功能中发挥一定作用。UCP4是特异存在于神经系统的解偶联蛋白,除延髓和胼胝体黑质中含量较低外,其他部位普遍可见。UCP5除了在脑中表达以外,在肾脏及睾丸也有所表达[17]。

UCP2在脑缺血再灌注损伤中的被广泛研究的解偶联蛋白之一,其含量变化与再灌注后的时间有关。在缺血1 h再灌注24 h组的大鼠脑组织中,UCP2水平较假手术组明显升高,而在缺血2 h再灌注2 h组的大鼠脑组织中,UCP2水平较假手术组显著降低[18]。结果提示,脑组织的受损伤机制可能因缺血时间不同而有所差别,UCP2在不同损伤时段发挥的作用也有所差异。在缺血早期,UCP2水平升高,有利于降低细胞内活性氧水平,减轻氧化应激,保护受损脑组织,这也体现了缺血后受损伤神经元内存在短暂的内源性代偿机制；但随着缺血损伤程度加重,代偿程度有限,部分神经元受到的损伤难以逆转,UCP2水平降低也在一定程度上反映了神经元线粒体的受损程度。作为特异性存在于神经系统的解偶联蛋白,UCP4在脑缺血再灌注损伤中的作用也具有一定研究意义。易传安[19]对缺血6 h再灌注24 h的脑缺血再灌注损伤的大鼠应用何首乌提取物,实验发现,何首乌提取物能浓度依赖性地减少脑缺血再灌注损伤的脑梗死面积并显著上调UCP4表达。研究表明,何首乌的有效成分可能通过提高神经元内线粒体UCP4的表达水平,发挥对缺血再灌注损伤脑组织的保护作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(peroxi-some proliferators-activated reptorγcoactivator-1α，PGC-1α)与UCP家族多个成员相关联,对UCP2、UCP4、UCP5有正向调节作用。在过表达PGC-1α的慢性缺血再灌注损伤的小鼠神经胶质细胞中,抗氧化剂SOD和UCP2、UCP4、UCP5的表达均显著上调,活性氧的产生减少,此外,海马中神经胶质细胞的激活减少,这些变化均有助于减轻神经元缺血再灌注损伤[20]。上述研究表明,线粒体UCP不仅能在一定程度上反映脑缺血再灌注的损伤程度,一些治疗方式也可以通过调节相关线粒体UCP的水平,减轻神经组织的缺血再灌注损伤,这对缺血再灌注损伤药物的研发以及治疗靶点的选择具有指导意义。

3.3 去乙酰化酶SIRTs属于第三类去组蛋白乙酰化酶,与酵母沉默信息调节子2同源,其在线粒体功能调节和预防氧化应激方面发挥重要作用。SIRTs在进化上高度保守,具有依赖于氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)的酶活性。SIRTs直接参与激活与活性氧产生和解毒有关的蛋白质底物,能够调节细胞增殖、DNA修复、抗氧化剂活性以及维持线粒体的能量稳态。SIRTs包括SIRT1～SIRT7七个家族成员,其各自所处环境不同,所行功能也各有差异[21]。

多种研究表明,SIRT1对神经系统疾病具有保护作用。在缺血再灌注损伤的大鼠脑组织中,SIRT1在缺血半暗带区表达异常[22]。在体外实验中,Qiannan Ren[23]等建立了氧和葡萄糖剥夺再灌注损伤的细胞模型,他们发现,过表达SIRT1可导致自噬相关标志性因子上调,以及细胞凋亡水平下调。结果表明,在脑缺血再灌注损伤的体外模型中,SIRT1可以促进细胞自噬,抑制细胞凋亡,从而起到对缺血再灌注损伤神经元的保护作用。在缺血再灌注损伤早期,细胞内NAD+因血氧供应不足被耗尽,细胞供能匮乏,而SIRT3具有NAD+依赖性,因此,再灌注损伤亦会导致SIRTs活性受到不同程度的抑制。Nina Klimova[24]等研究表明,NAD+合成的重要前体之一烟酰胺单核苷酸(nicotinamidemononucleotide，NMN)对缺血性再灌注损伤的脑组织具有保护作用,这种保护作用的发挥与对SIRT3水平及其所依赖后续机制的调节有关,NMN能有效保有缺血再灌注损伤神经元线粒体结构和功能的完整性,抑制活性氧产生,减轻脑组织缺血再灌注损伤。黄凤英[25]对脑缺血再灌注损伤的小鼠模型应用民间草药多穗石柯的活性成分三叶苷(trilobatin，TLB)治疗,结果发现,TLB能浓度依赖性地促进损伤神经元的增殖修复,改善缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,且药物作用机制与对SIRT7/VEGFA信号通路的调控有关。VEGFA是血管内皮生长因子之一,因此,该实验也说明,在脑缺血再灌注损伤中,SIRTs不仅能通过调节氧化应激和能量供应来直接保护受损神经元,并且在修复受损微血管、促进血管新生等方面也发挥一定积极作用。

4 小结

缺血缺氧性疾病的形成和发展是一个复杂的病理过程，在恢复血流灌注后，相应组织的再灌注损伤难以避免。线粒体在能量代谢中起关键作用，而神经元对能量供应非常敏感，因此，线粒体自身结构和功能的稳定性对神经元损伤有重要影响。氧化应激是缺血再灌注损伤的病理机制之一，线粒体是活性氧产生的主要部位，因此线粒体内氧化应激相关分子在脑缺血再灌注损伤的进程中扮演重要角色。相信随着对缺血再灌注损伤神经元线粒体结构和功能稳定性以及氧化应激病理机制研究地不断深入，围绕线粒体氧化应激相关分子在脑缺血再灌注损伤中作用的研究将为疾病病理机制的明晰、病程的发展和治疗提供新的思路和方法。