miRNA在高磷诱导的血管钙化中的作用

贾娟，梁思，陈恒利，王红杰，2，3

(1.河北大学附属医院，河北 保定 071000；2.河北大学基础医学院，河北 保定 071000；3.河北省慢性肾脏病骨骼代谢生理学重点实验室，河北 保定 071000)

慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)严重危害人类身心健康，已经成为全世界主要的健康问题之一。CKD 3期及以上患者[即肾小球滤过率(eGFR)<60 mL/(min·1.73 m2)]随着肾功能下降，全因死亡率及心血管死亡风险显著升高[1]。Cano-Megías等[2]通过对137例终末期CKD患者进行为期10年的随访发现，CKD患者的总病死率为58%，其中40%是由心血管事件导致。调整年龄、性别等混杂因素后，钙磷代谢异常是导致CKD患者冠状动脉钙化的危险因素之一[3]。Gravesen等[4]将尿毒症大鼠钙化的血管移植到正常大鼠，脱离了尿毒症和高磷血症环境后血管组织中的钙含量无明显变化，进一步说明预防血管钙化的重要性，血管钙化一旦形成，很难逆转。因此,充分了解及研究血管钙化的机制，预防并阻止血管钙化的发生极其重要。近期随着蛋白组学的发展，越来越多研究发现，高磷环境的刺激可促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化。主要表现为促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化的相关因子如成骨因子Runt相关转录因子2(runt related gene 2, Runx2)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、核转录因子-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κBligand,RANKL)等表达增加，抑制血管钙化的因子如骨保护素(osteoprotegerin, OPG)等表达下降。微小RNA(microRNA, miRNA)可通过在转录后水平调控促进或抑制钙化形成的因子，进而起到调控血管钙化的作用，因此将与高磷诱导的血管钙化相关的miRNA进行综述，希望为高磷诱导的CKD患者血管钙化的治疗提供新的方案。

1 高磷状态下，抑制血管钙化的miRNA

1.1 miR-26a

Wu等[5]发现,在β磷酸甘油干预下，miR-26a和OPG在血管平滑肌细胞中表达降低，RANKL及ALP表达增加。过表达miR-26a后，RANKL及ALP表达下降，血管钙化减轻。结果表明，miR-26a可能通过调节成骨相关基因及蛋白的表达，从而发挥调节血管钙化的作用[5]。

1.2 miR-29a/b

关于miR-29a/b在高磷诱导的血管钙化中发挥的作用，结论尚未统一。Lee、Panizo和Sudo等认为miR-29a/b起到促进血管钙化的作用。Lee等[6]在存在血管钙化的透析患者循环中发现，miR-29a/b水平与钙化的程度呈正相关，且与透析患者的病死率密切相关。Panizo等[7]研究显示，高磷状态下，miR-29b表达增加与Runx2表达呈正相关，认为miR-29b可能通过促进成骨样细胞因子的表达，起到促进血管钙化的作用。Sudo等[8]研究显示，在高磷状态下，miR-29表达增加，同时血管平滑肌细胞弹性蛋白的表达下降，血管钙化加重，抑制miRNA-29后，可恢复弹性蛋白的表达，认为miR-29可能通过抑制弹性蛋白的表达，从而促进血管钙化。但是，Du等[9]认为，miR-29a/b起到抑制血管钙化的作用。软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)缺乏可导致血管钙化，而解聚蛋白样金属蛋白酶-7(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs 7, ADAMTS-7)可降解损伤血管中的COMP，进而促进血管钙化的发生。Du等[10]还认为，miR-29a/b与ADAMTS-7的表达成负相关，抑制miR-29a/b后，ADAMTS-7表达上调，从而促进COMP降解，加重血管钙化。目前，对于miR-29a/b在血管钙化中发挥的作用尚不完全清楚，仍需进一步研究。

1.3 miR-30b

在高磷环境的刺激下，血管平滑肌细胞发生氧化应激，线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)增加，自噬相关蛋白LC3II/LC3I及Beclin1表达增加，从而诱导细胞发生自噬。miR-30b与MMP、LC3II/LC3I、Beclin1表达呈正相关，过表达miR-30b后，MMP及自噬相关蛋白(LC3、Beclin1)表达上调，成骨细胞相关蛋白Runx2和肌节同源盒基因同系物2(muscle segment homeobox, Msx2)表达下降，血管钙化减轻[11]。性别决定区Y-box9(Sox9)基因在软骨细胞发育和肥大软骨细胞的变化中起着重要作用[12]。通过荧光素酶测定证实，miR-30b的作用靶点为Sox9，增加miR-30b表达后可显著降低Sox9的表达。此外，在钙化的人冠状动脉中BMP-2可通过下调miR-30b/c导致Runx2表达增加，促进血管钙化[13]。而miR-30b/c是通过与Runx2的3′非编码区结合，调节Runx2的表达。

1.4 miR-34b

高磷状态下，miR-34b在细胞水平、动物水平及尿毒症患者中表达均受到抑制，且与钙化的程度呈负相关[14]。miR-34b表达下调是因为DNA甲基转移酶3a(DNA methyltransferase 3a, DNMT3a)表达增加，导致miR-34b DNA上游CpG位点甲基化，予以甲基化转移酶抑制剂5-aza-2′-脱氧胞苷(5-aza)降低miR-34b甲基化速率后，可恢复miR-34b表达。当敲除DNMT3a后，发现3.5 mmol/L磷对血管平滑肌细胞钙化无影响，进一步研究发现，Notch1的3′非编码区序列包含一个与miR-34b序列互补的序列。miR-34b过度表达可降低Notch1表达，抑制后可增加Notch1表达[14]。由此认为，miR-34b发挥抑制血管钙化的作用受上游DNA甲基化和下游靶基因Notch1的调节。

1.5 miR-103

高磷状态下，血管平滑肌细胞miR-103表达水平下降，Runx2表达上调，ALP活性增强，血管钙化加重，过表达miR-103后，Runx2表达下降，ALP活性降低，血管钙化减轻[15]。miR-103可能通过负向调节Runx2表达发挥抑制血管钙化的作用。

1.6 miR-125b

高磷干预下，miR-125b在人主动脉血管平滑肌细胞中表达与钙化的程度呈负相关，Goettsch等[16]认为,miRNA-125b发挥作用一部分是通过靶向调节成骨转录因子SP7实现，一部分是通过抑制Runx2和ALP表达实现。Chen等[17]认为，miR-125b在CKD大鼠胸主动脉中表达下降，但是Drosha酶及Dicer酶表达无差异，推测其表达下降可能与细胞内加工的改变无关。Wen等[18]认为，可调控整合素、血管内皮钙黏蛋白等与细胞黏附和内皮细胞迁移相关的Ets1[19]是miR-125b的靶向目标。

1.7 miR-133/miR-145/miR-205

研究[7，17，20-21]表明，高磷状态下，miR-133a/b、miR-145及miR-205在血管平滑肌细胞的表达显著下降，与此同时Runx2表达增加,血管钙化加重。Liao等[20]认为，在敲除Runx2基因的细胞中miR-133a抑制剂不能起到促进血管钙化的作用,证明miR-133a的直接作用靶点为Runx2。Chen等[17]认为，miR-145在CKD大鼠血管平滑肌细胞中表达下降，但是Drosha酶和Dicer酶的表达无显著变化，miR-145表达下降可能与细胞内加工无关。Qiao等[21]研究表明，miR-205可能靶向抑制Runx2和smad1表达水平而减轻高磷诱导的血管钙化。

1.8 miR-182

Sortilin1(SORT1)与动脉粥样硬化的发生发展相关。Zhang等[22]认为，在β磷酸甘油干预下血管平滑肌细胞miR-182表达下降，并且与SORT1表达呈负相关。在体外实验中，通过下调SORT1表达后可抑制β磷酸甘油诱导的血管平滑肌细胞钙化。通过荧光素酶分析证实SORT1是miR-182的直接靶点，提示miR-182可通过调节SORT1调节血管钙化。

1.9 miR-204

高磷刺激下，血管平滑肌细胞miR-204表达下调，Runx2表达显著增加。Cui等[23]通过荧光素酶分析得出，miR-204的直接作用靶点是Runx2。此外，Lin等[24]在细胞、动物及透析患者中通过测序得出，miR-204基因上游的CpG位点发生高甲基化，DNMT3a可加重高磷诱导的血管平滑肌细胞miR-204甲基化，予以5-aza可恢复miR-204表达，由此推测DNMT3a是miR-204的靶点。

1.10 miR-302b

miR-302b在CKD大鼠中表达下调，增加其表达后，可降低BMP-2/Runx2/osterix信号的表达，改善CKD大鼠钙磷代谢及减轻血管钙化[25]。因此认为，miR-302b改善血管钙化，可能通过抑制BMP-2/Runx2/osterix信号通路的表达实现。

2 高磷状态下，促进血管钙化的miRNA

2.1 miR-32

Liu等[26]研究表明，在β磷酸甘油干预下，小鼠平滑肌细胞miR-32表达增加，并且增强BMP-2、Runx2、ALP表达，促进了钙化。miR-32一方面通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)信号通路，另一方面通过调控磷酸酶和张力蛋白同源mRNA的3′非编码区增加血管平滑肌细胞Runx2的表达和磷酸化，从而调控血管钙化。Liu等[26]同样在冠状动脉钙化的患者血浆中发现miR-32水平高于非冠状动脉钙化患者,认为miR-32可作为诊断冠状动脉钙化的潜在标志物。

2.2 miR-3960/miR-2861

Xia等[27]在实验中得出，高磷状态下，miR-3960和miR-2861在血管平滑肌细胞中的表达显著增加。过表达miR-3960与miR-2861后，显著促进了血管平滑肌细胞的成骨作用，反之亦然。miR-3960与miR-2861可分别通过组蛋白去乙酰化酶5(histone deacetylase 5，HDAC5)或Homeobox A2促进Runx2蛋白产生，进而加重血管钙化。

2.3 miR-134

在高磷干预下，大鼠血管平滑肌细胞中miR-134-5p表达增加，同时成骨细胞相关因子Runx2和BMP-2表达增加，OPG表达下降。过表达HDAC5后，可减轻miR-134-5p诱导的钙沉积。通过生物学分析发现，HDAC5的3′非编码区是miR-134-5p的作用靶点。结果表明，高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化，可能通过促进miR-134-5p增加，而抑制HDAC5产生发挥作用[28]。

2.4 miR-223

Rangrez等[29]研究表明，在高磷环境下，血管平滑肌细胞miR-223的表达增高。过表达miR-223可促进血管平滑肌细胞增殖和迁移，并且减少血管平滑肌细胞特异性蛋白SMα-actin表达。miR-223主要通过下调miR-223靶点Mef2c和RhoB表达而实现促进血管平滑肌细胞表型转变。

3 展望

血管钙化是心血管疾病的病理基础。心血管疾病是慢性肾脏病患者的主要死亡原因。近年来，随着蛋白组学的发展，miRNA在血管钙化中的研究日益深入，越来越多miRNA被发现参与了血管钙化的过程。然而，miRNA是一个庞大的家族，且其确切的功能仍需要继续深入研究。因此，研究miRNA基因对高磷诱导的血管钙化的具体机制仍任重道远。因此深入研究miRNA在高磷诱导的血管钙化中的作用机制，有望为CKD患者血管钙化的诊断和干预提供新的靶点。