采用HPLC法测定盐生肉苁蓉中苯乙醇苷类含量

杨 雯，石 妍

(1.内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010000；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014000)

肉苁蓉，始载于《神农本草经》，在历代补益性中药处方中出现率占第1位[1]。现在普遍认为我国肉苁蓉属植物有4种和1变种，分别为肉苁蓉(又名荒漠肉苁蓉)Cistanche deserticola Y.C.Ma、管花肉苁蓉C.tubulosa(Schenk)Wight、盐生肉苁蓉C.salsa(C.A.Mey.)G.Beck、沙苁蓉 C.sinensis G.Beck 及白花盐苁蓉 C.salsa var.albiofora P.F.Tu et Z.C.Lou，var.nov[2]。目前市场上流通的药材肉苁蓉主要来源于荒漠肉苁蓉、管花肉苁蓉、盐生肉苁蓉和沙苁蓉这4种肉苁蓉属植物，其中，荒漠肉苁蓉、盐生肉苁蓉和沙苁蓉为我区地产品种。由于对肉苁蓉的开发较早，人们对于荒漠肉苁蓉的认识较深，应用也更为广泛，而对盐生肉苁蓉和沙苁蓉的研究并不深入。苁蓉类药材的化学成分包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖类、生物碱类、挥发油类等多种活性成分[3-6]。其中，苯乙醇苷类是主要化学成分，具有补肾壮阳、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、增强记忆力之功效[7-12]。故本课题将对苯乙醇苷类活性成分进行测定分析，为今后肉苁蓉类药材的评价提供参考依据。

1 仪器、试药及样品

1.1 仪器

岛津LC-20A型高效液相色谱仪；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AE100型万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ME5型百万分之一天平(德国赛多利斯公司)。

1.2 试剂与试药

对照品毛蕊花糖苷(111530-201713，中国食品药品检定研究院)、松果菊苷(111670-201706，中国食品药品检定研究院)。

色谱乙腈(SIGMA-ALDRICH)、色谱甲醇(SIGMA-ALDRICH)、甲醇、甲酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、实验用水为纯化水。

实验共收集到13批盐生肉苁蓉药材，具体情况见表1所示。

表1 盐生肉苁蓉药材采收情况表

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱条件如下[13-16]，色谱柱：AlltimaC18柱(250×4.6mm5μm)，流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱程序见表2，流速：1.0mL·min-1，柱温：35℃，检测波长：330nm；进样量：10μL。HPLC色谱图见图1，光谱图见图2。

盐生肉苁蓉混合对照品

松果菊苷光谱图

表2 流动相洗脱程序

2.2 供试品溶液的制备

精密称取干燥的盐生肉苁蓉粉末(65目)约1.0g，加入70%甲醇溶液50mL，称量，浸泡30min后，超声提取30min后，放冷后加70%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液以0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品适量，采用30%的甲醇溶解，分别制成每1mL含0.50mg、0.40mg的对照品溶液，即得混合对照品溶液，保存于4℃冰箱中，备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围

精密吸取上述混合对照品溶液1.0μL、2.0μL、6.0μL、10.0μL、15.0μL、20.0μL、25.0μL进行测定，所得结果见表3，表明对照品在各自进样范围内呈良好的线性关系。

表3 回归方程及线性范围

2.4.2 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液10μL，连续进样6次，测定松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面积积分值，计算RSD分别为0.19%、0.26%。结果表明仪器精密度良好。数据见表4。

表4 精密度试验数据

2.4.3 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液(Y5样品)10μL，于制备后0h、2h、4h、8h、12h分别进样测定松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面积积分值，计算RSD分别为0.32%、0.47%，结果表明供试品溶液在12h内稳定。数据见表5。

表5 稳定性试验数据

2.4.4 重复性试验

精密称取同一供试品(Y5样品)6份，按照上述方法进行供试品溶液的制备，并按上述色谱条件分别进样10μL。测定计算松果菊苷、毛蕊花糖苷含量的平均值(n=6)分别为1.47%、0.87%，RSD分别为0.53%、0.93%。结果表明方法重复性较好。数据见表6。

表6 重复性试验数据

2.4.5 加样回收试验

取同一供试品(Y5)，平行取样精密称定6份置于锥形瓶中，各约0.25g，分别将适量对照品溶液加入各锥形瓶中，按上述方法制备供试品溶液，按外标法计算松果菊苷、毛蕊花糖苷的平均回收率依次为99.9%、98.8%，RSD依次为0.39%、1.11%(n=6)，表明该方法测定结果准确。试验数据见表7。

表7 加样回收试验

2.4.6 耐用性试验

取同一供试品溶液(Y3)，采用不同色谱柱，按上述色谱条件进行测定，计算盐生肉苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷的平均含量，RSD均小于3%，表明该方法对于不同色谱柱的耐用性良好，试验数据见表8。

表8 不同色谱柱测得盐生肉苁蓉3号样中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量

2.5 样品含量测定

取13批盐生肉苁蓉，制备成供试品溶液后进行测定，结果分别见表9。

表9 盐生肉苁蓉含量测定结果(n=2)

3 讨论

3.1 样品提取条件的优化

本实验对提取溶剂进行考察：分别考察了以30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇为提取溶剂制备供试品溶液，结果显示当以70%甲醇溶液进行提取时，盐生肉苁蓉中苯乙醇苷的含量达到最大值。故选择70%甲醇溶液作为提取溶剂。对提取时间进行考察：本实验分别考察了超声时间15min、30min、45min、60min对待测成分的提取效果，测定结果显示当超声提取时间为30min时，盐生肉苁蓉中苯乙醇苷类含量达最高，并且在45min以后含量下降，故选择超声时间为30min。对超声功率进行考察：考察了250W、400W、500W对待测组分的影响，结果表明各功率下提取效率基本一致，故参照2015版药典肉苁蓉项下供试品溶液制备的超声条件：功率250W、频率40kHz。

3.2 色谱条件的优化

本实验考察了4种流动相，分别为甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水，结果显示，采用甲醇-0.1%甲酸水流动相系统，各峰的基线平稳、峰形好，且各待测成分的分离度符合要求，因此，最终采用甲醇-0.1%甲酸水系统作为流动相系统。同时，本实验也考察了不同型号色谱柱Shim-pack C18(250mm×4.6mm，5μm)、Agilentzobarx C18(250mm×4.6mm，5μm)、Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)对测定结果的影响，结果表明采用不同色谱柱对实验结果没有影响，耐用性良好。