女贞子提取物预防产蛋后期蛋鸡脂肪肝的研究

李晓丽， 何万领，2， 王毅博， 李旺， 丁轲， 马彦博， 李元晓， 曹平华， 赵龙妹

(1.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471023；2.河南省生物发酵微量元素及安全评价工程技术中心，河南 鹤壁 456250)

脂肪肝综合征(fatty liver hemorrhagic syndrome, FLS)是蛋鸡集约化笼养过程中最常见的营养代谢性疾病[1-2]。据调查，中国蛋鸡FLS发生率高达30%以上，且多发生于产蛋期鸡群，同时导致蛋鸡产蛋量下降幅度高达60%，给蛋鸡养殖业造成巨大经济损失[3]。FLS作为制约蛋鸡养殖业健康发展的重要因素，长期以来在实际生产中尚无有效措施对其进行控制和预防。女贞子是木犀科常绿乔木女贞(LigustrumlucidumAit)的成熟果实，富含多种营养成分和生物活性物质[4-5]，具有滋补肝肾、调理肝功能等作用[6]。研究发现，女贞子能明显降低糖尿病和高脂诱导的大鼠血液和肝中甘油三酯(total glyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)以及低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDLC)的浓度，减少肝脂肪沉积[7-8]。作者前期研究也证实，以女贞子为主成分的复合中草药添加剂能够降低蛋鸡血清中TG和TC浓度[9]。以上结果表明，女贞子及其提取物在蛋鸡FLS预防上具有广阔的应用前景。为此，本试验通过在产蛋后期蛋鸡日粮中添加不同含量的女贞子提取物(Ligustrumlucidumextract, LLE)研究其对蛋鸡脂肪肝的预防效果及可能机制，为女贞子提取物在预防蛋鸡FLS的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

女贞子于2018年10月采自河南科技大学试验牧场。将女贞子于70 ℃中干燥，保存于通风干燥处备用。LLE的提取参考高亮亮等[10]的方法。提取物活性成分采用高效液相色谱仪(Waters2695，美国)测定，其中LLE中女贞多糖含量155 g·kg-1，齐墩果酸含量13.2 g·kg-1。

1.2 试验设计及饲粮组成

试验采用单因子完全随机试验设计，将体质量均匀、健康的360只500日龄海兰褐蛋鸡(Hy-Line Brown laying hens)随机分为6组，每组3个重复，每个重复20只，试验期30 d。Ⅰ组为对照组，饲喂玉米-豆粕型基础饲粮；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组为高能低蛋白日粮试验组，分别在日粮中添加0、500、1 000、1 500、2 000 mg·kg-1的LLE。基础饲粮组成及其营养成分见表1。其中，预混料为1 kg饲粮中包含维生素A 7 500 IU、维生素D32 500 IU、维生素E 35 mg、维生素K31 mg、维生素B11.5 mg、维生素B24 mg、维生素B62 mg、维生素B120.02 mg、烟酸30 mg、叶酸0.55 mg、泛酸10 mg、生物素0.16 mg、氯化胆碱420 mg、铁元素64 mg、锌元素72 mg、铜元素15 mg、锰元素85 mg、碘元素0.4 mg。

1.3 饲养管理

采用3层阶梯笼养，每笼饲养3只鸡。采用人工光照和自然光照相结合的方法，每天光照17 h。试验蛋鸡自由采食，采用乳头式饮水器自由饮水。每天6:30和17:30分别上料1次，采用自由采食和饮水，参照免疫程序防疫，定期清理粪便并维护环境卫生。

1.4 样品采集

试验30 d后每组重复取6只鸡，禁食12 h后空腹称鸡体质量，并进行翅下静脉采血，3 000 r·min-1离心10 min，制备血浆，-20 ℃冻存。将蛋鸡麻醉处死，取出整个肝，用预冷生理盐水冲洗，滤纸擦干称质量。剥离试验鸡的腹部脂肪及肌胃周围脂肪后称质量。取5 mm肝组织块，置于体积分数4%的多聚甲醛溶液中固定，用于肝病理检查。取1 mm3的肝组织块，置于体积分数2.5%的戊二醛溶液中固定，用于透视电镜(Talos F200X S/TEM，Thermo Fisher)观察肝的超微结构变化。其余肝组织用锡箔纸包装，-20 ℃液氮速冻备用。试验符合动物伦理要求及动物福利法相关规定。

肝匀浆制备方法：称取肝组织2 g，加入9倍体积生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，12 000 r·min-1离心5 min(M1324R，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，取上清液待测。

1.5 指标测定

1.5.1 肝指数、肝脂率及腹脂率指标测定 参照邢玉娟等[11]的方法，稍作修改。鸡解剖后，将肝和腹部脂肪完整取出，称质量，计算肝指数和腹脂率；取部分肝，烘干并研磨，采用索氏化学抽提法测定肝脂率。为消除样品前处理过程中水分损失造成的误差，本研究以抽提脂肪质量占风干样品质量(65 ℃烘干15 h)的比例作为肝脂肪含量指标。

肝指数=肝湿质量/体质量×100%

(1)

肝脂率=(提取前滤纸包干质量-提取后滤纸包干质量)/(提取前滤纸包干质量-滤纸干质量)×100%

(2)

腹脂质量=腹部脂肪质量+肌胃周围的脂肪质量

(3)

腹脂率=腹脂质量/活体质量×100%

(4)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Basic diet and its nutritional ingredients (air-dry basis)

1.5.2 血清和肝抗氧化指标 采用比色法测定血清和肝中总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)活性，采用羟胺法测定血清和肝中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性，采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法测定血清和肝中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。肝组织蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝法，具体操作步骤按照说明书进行，试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.5.3 血清和肝脂质代谢指标 采用赖氏法测定血清和肝中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)活性，采用甘油三酯测定试剂盒(GPO-PAP法)和总胆固醇试剂盒(COD-PAP法)测定血清和肝中TG和TC浓度。肝组织蛋白浓度的测定方法同上。

1.5.4 肝组织切片制备及病理学观察 在肝最大叶距边缘5 mm处切取小片肝组织块，立即固定于体积分数4%多聚甲醛溶液和体积分数2.5%的戊二醛溶液中，进行常规脱水包埋，采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，用光学显微镜观察肝脂肪病变(×400)；用电子显微镜观察肝组织线粒体、内质网、细胞核超微结构的变化(×5 000)。切片制作均在武汉赛维尔生物科技有限公司进行。

1.6 统计分析

采用SPSS20.0中的单因素方差分析法进行统计分析，均值的多重比较采用Duncan’s法进行，以P<0.05作为差异显著性判断标准，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 女贞子提取物对产蛋后期蛋鸡肝指数、肝脂率及腹脂率的影响

由表2可知，与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组肝指数、腹脂率及肝脂率分别显著升高了54.02%、170.41%和181.60%，LLE能够降低以上指标。与试验Ⅱ组相比，试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组肝指数和肝脂率分别显著降低了40%和30.65%、42.61%和29.21%、46.67%和31.74%、45.51%和32.6%，试验Ⅲ组和Ⅴ组腹脂率显著降低了48.93%和47.04%。

表2 女贞子提取物对产蛋后期蛋鸡肝指数、肝脂率及腹脂率的影响Table 2 Effect of LLE on liver index, liver fat rate and abdominal fat rate of laying hens in late laying stage %

2.2 女贞子提取物对产蛋后期蛋鸡血清、肝抗氧化能力的影响

由表3可知，在血清中，与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组GSH-PX含量显著降低了9.91%，MDA含量显著升高了80.57%，而SOD和T-AOC含量也有所降低，但不显著。与试验Ⅱ组相比，试验Ⅳ、Ⅴ组中GSH-PX含量显著升高，试验Ⅴ组中MDA含量显著降低；试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组中SOD含量有所升高，试验Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组中T-AOC含量有所升高，但均不显著。在肝中，与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组SOD、GSH-PX和T-AOC含量分别显著降低了31.06%、25.42%和23.84%，而MDA含量显著升高了69.49%。与试验Ⅱ组相比，试验Ⅲ、Ⅴ组中SOD含量显著升高，试验Ⅳ、Ⅴ组中GSH-PX含量显著升高，试验Ⅴ组中T-AOC含量显著升高，而试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组中MDA含量显著降低。

表3 女贞子提取物对产蛋后期蛋鸡血清、肝抗氧化能力的影响Table 3 Effect of LLE on the serum and antioxidant capacity of liver of layers in late laying period

2.3 女贞子提取物对产蛋后期蛋鸡血清、肝脂质代谢的影响

由表4可知，与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组血清ALT含量显著升高了151.16%，TG、TC和AST含量有所上升，但差异不显著；与试验Ⅱ组相比，试验Ⅲ、Ⅴ组中血清AST含量显著降低，试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组中血清ALT含量显著降低；与试验Ⅱ组相比，试验Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组中TG、TC含量有所降低，但差异不显著。与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组肝TG、TC、AST和ALT含量分别显著升高了57.54%、36.55%、26.65%和59.97%；LLE试验组肝各项脂质指标均有所下降，与试验Ⅱ组相比，试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组中AST、ALT含量显著降低，试验Ⅳ、Ⅵ组中TG含量显著降低，试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组中TC含量显著降低。

表4 女贞子提取物对产蛋后期蛋鸡血清、肝脂质代谢的影响Table 4 Effects of LLE on serum and liver lipid metabolism of layers in late laying period mmol·L-1

2.4 女贞子提取物对产蛋后期蛋鸡肝组织病理学观察

由图1可知，试验Ⅰ组肝外形正常，无脂肪沉积的黄染现象;试验Ⅱ组肝肿大，脂肪黄染现象明显，并出现肝脆性增加，解剖时出现不易成型、易碎等现象；与试验Ⅱ组相比，试验Ⅲ和Ⅳ组肝有黄染现象，但结构成型性较好，试验Ⅴ组和试验Ⅵ组肝大小正常，结构清晰，无脂肪沉积的黄染现象。由图2可知，试验Ⅰ组肝细胞大小均匀，肝小叶、肝索结构明显存在，无肝细胞脂肪病变；试验Ⅱ组，大部分肝细胞肿大且胞质疏松化，呈现重度空泡样变性和气球样变性，形成大量的脂肪滴，肝小叶消失，肝索紊乱，仅存在少量的正常肝细胞，胞核位于中央或被挤到一侧；与试验Ⅱ组相比较，LLE添加组(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组)均表现出不同程度的缓解，肝细胞脂肪变性及脂肪滴数量减少，部分肝索排列紊乱，当LLE添加量为1 500 mg·kg-1(Ⅴ组)时，肝脂肪病变得到有效缓解，无空泡样变性。

注：Ⅰ基础日粮组；Ⅱ～Ⅵ高能低蛋白日粮试验组(分别添加0、500、1 000、1 500和2 000 mg·kg-1女贞子提取物)。下同。

注：箭头所指为空泡样变性。下同。

由图3可知，试验Ⅰ组在电镜下肝细胞中线粒体遍布胞质，呈椭圆形或圆形，线粒体膜和基质明显，线粒体嵴稠密，结构清晰，胞质中未见脂滴，且含有丰富的内质网和核糖体，核膜连续且染色质分显，并出现肝脆性增加，解剖时出现不易成型、易碎等现象；与试验Ⅱ组相比，试验Ⅲ组和Ⅳ组肝有黄染现象，但结构成型性较好，试验Ⅴ组和试验Ⅵ组肝大小正常，结构清晰，无脂肪沉积的黄染现象。由图2可知，试验Ⅰ组肝细胞大小均匀，肝小叶、肝索结构明显存在，无肝细胞脂肪病变；试验Ⅱ组大部分肝细胞肿大、胞浆疏松化，呈现重度空泡样变性和气球样变性，形成大量的脂肪滴，肝小叶消失，肝索紊乱，仅存在少量的正常肝细胞，胞核位于中央或被挤到一侧；与试验Ⅱ组相比较，LLE添加组(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组)均表现出不同程度的缓解，肝细胞脂肪变性及脂肪滴数量减少，部分肝索排列紊乱，当LLE添加量为1 500 mg·kg-1(Ⅴ组)时，肝脂肪病变得到有效缓解，无空泡样变性。

注： 内质网；线粒体；脂滴; 核糖体。

3 结论与讨论

蛋鸡有为能而食的天性，但过高的日粮能量会造成蛋鸡机体组织器官的生理变化和脂质积累[12]。研究表明，日粮能量与肝指数呈正比[13]。本研究结果表明，与10.82 MJ·kg-1代谢能的基础日粮组相比，采用11.75 MJ·kg-1代谢能的日粮组蛋鸡肝指数显著升高。肝脂和腹脂是反映脂质代谢的重要指标，较高的能量会促进肝脂和腹脂的沉积[14-15]。本研究中，LLE添加组蛋鸡肝指数、肝脂率和腹脂率显著降低，并呈现一定的剂量效应关系，表明LLE能够促进蛋鸡脂质代谢，降低蛋鸡脂肪肝发生。

蛋鸡在正常情况下，肝脂质合成与输出保持平衡，疏泄有度，脂质不会在肝发生明显的沉积。但是，当肝脂肪来源多于脂肪输出时，过多的脂肪便沉积于肝细胞内。这是因为蛋鸡长期饲喂高能低蛋白，肝将多余能量转化为脂质，运送出血液或相应器官，而肝中合成脂蛋白或载脂蛋白的蛋白质不足，使其转运受阻，破坏了肝细胞、脂肪和血液之间脂肪代谢的动态平衡，导致以中性脂肪为主的脂质在肝细胞过度沉积[26]。研究表明，LLE中的苯丙烷类糖苷成分可以降低血浆和肝中的TG和TC浓度[27]。马得莹等[28]研究发现女贞子有降低血清中TC浓度的趋势。王环宇[24]研究表明，女贞子萃取物可显著增加肉仔鸡血清中高密度脂蛋白含量，降低TC浓度和低密度脂蛋白含量，并有降低ALT和AST活性的趋势。本试验结果发现，在高能低蛋白质饲粮中添加LLE可以改善蛋鸡脂质代谢，降低血清和肝中TC、TG的浓度以及ALT、AST的活性，这与上述研究结果相一致。该结果表明，LLE可缓解高能低蛋白日粮下蛋鸡肝脂质代谢负担。

肝是蛋鸡脂质代谢的主要场所，机体几乎全部脂肪是在肝中合成与代谢。但家禽肝储存脂肪能力较低，较多的脂类物质在肝中积累易造成一系列病理变化，如肝肿大、肝脂率增高、组织脂质空泡变性及结构损伤等[26]。本试验结果表明，在11.75 MJ·kg-1代谢能下，蛋鸡肝肿大、黄染现象明显，且肝结构模糊；组织镜检发现，肝细胞中有大量空泡样变性，细胞核周围脂滴大量分布，线粒体损伤严重，表现为线粒体膜损伤、基质减少或消失、内质网膜损伤及肿大等病理变化，符合蛋鸡脂肪肝综合征特征[29-30]。研究表明，长时间高能低蛋白饲喂会造成肝游离脂肪酸和TG的积累，从而增强线粒体的脂肪酸氧化、三羧酸循环以及氧化磷酸化过程[31]，而氧化和磷酸化的解偶联以及氧自由基产生和脂质过氧化作用的增加会导致细胞损伤[32]。ROS的产生引起脂肪酸氧化障碍，造成脂肪集聚以及线粒体畸形、增大和嵴的丧失[33]。但本试验结果表明，在高能低蛋白质饲粮中，随着LLE添加量增加，蛋鸡肝肿大消失，颜色正常，镜检可见细胞脂肪变性得到有效缓解，线粒体、内质网等亚单位损伤减少。这表明LLE能够有效降低脂质过氧化应激，减少“二次”打击对肝细胞的损害。饲粮中添加1 500 mg·kg-1的LLE可显著促进高能低蛋白饲粮下蛋鸡脂质代谢，降低血清、肝脂肪积累，保护肝细胞结构和功能完整性，从而降低脂肪肝综合征的发生率。