小麦黑胚病抗性位点检测研究进展

李巧云，高闯，张芳芳，李俣佳，陈向果，高艳，唐建卫，殷贵鸿

(河南农业大学农学院/国家小麦工程技术研究中心/省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室，河南 郑州 450046)

小麦黑胚病(black point disease)是指小麦籽粒胚部有褐色至黑色斑点的病害,严重时症状可能延伸至籽粒腹侧及冠毛端，甚至引起籽粒皱缩[1-4]。该病害不仅影响小麦籽粒外观品质、降低小麦收购级别，导致发芽率和出苗率下降[4-6],而且感病籽粒还会毒素污染[7-11]，直接影响用种安全和食品安全。因此，许多国家对小麦黑胚率有严格的规定，如澳大利亚仓贮种子的黑胚率上限为5%[6]，GB 1351—2008规定，三等以上小麦不完善粒应≤6%，其中，黑胚粒是小麦不完善粒的6种类型之一[12]。近年来，随着小麦品种更新换代、水肥条件改善以及小麦成熟期间气候的变化，黑胚病呈现加重的趋势，已引起社会的广泛关注[13-15]。种植抗病品种是防治黑胚病最经济有效的途径。然而，目前中国生产上推广的小麦品种普遍感黑胚病[4,13-14,16-17]，优异抗黑胚病小麦种质资源与实用分子标记缺乏，阻碍了抗黑胚病小麦品种的育种进程。本研究就小麦对黑胚病的抗性遗传特点、抗性位点及候选基因检测的研究进行综述，并对研究中存在的问题进行思考，以期为小麦黑胚病抗性遗传研究提供参考，尽早开发小麦抗黑胚病主效位点连锁或共分离的分子标记，促进中国小麦抗黑胚病分子育种进程。

1 黑胚病抗性遗传特点、影响因素及抗源筛选研究现状

1.1 小麦黑胚病抗性遗传特点研究进展

基因型、地点、年份的互作效应对黑胚病发病率影响较大[4,18-20]。抗感病亲本杂交组合F1的黑胚率介于两亲本之间[21]，F2群体单株的黑胚率呈现正态分布特点、并具有超亲现象[17,22]，表明小麦对黑胚病的抗性是由多基因控制的。王丝雨等[23]用盖钧镒和章元明的“主基因+多基因混合模型”分析方法对源于宛原白1号/山农4143组合的F7代重组自交系(recombinant inbred line,RIL)群体进行遗传分析的结果表明，黑胚病抗性遗传符合“4对主基因+加性-上位性多基因”模型。STATLER等[1]以硬粒小麦(Durum wheat)品种Leeds(R)与Golden Ball(S)为亲本，构建正交与反交的F1、F2、F3及回交群体，对上述遗传群体的研究结果表明，小麦对黑胚病的抗性与母本影响无关。这些研究结果表明，小麦对黑胚病的抗性具有数量性状的特点。

1.2 小麦黑胚病发生的影响因素研究进展

在不考虑品种抗性差异的情况下，小麦黑胚病的发生主要受2个因素的影响。(1)致病菌：小麦黑胚病致病菌复杂，不同地区报道的致病菌不一致。多数学者认为，链格孢 (Alternariaalternata)[24-27]、麦根腐平脐蠕孢 (Bipolarissorokiniana)[24,26-28]与镰刀菌属真菌 (Fusariumspp.)[10,24,29]是小麦黑胚病的主要致病菌。国家小麦工程技术研究中心小麦遗传育种课题组从3个自然环境条件下收获的感黑胚病小麦品系的感病籽粒上分离到21个真菌菌株，属于11个真菌属，经过致病性鉴定，其中10个菌株引起黑胚率显著增加，形态学鉴定与系统进化树分析表明，10个菌株属于6个真菌属中的8个真菌种，分别为A.alternata、B.sorokiniana、Bipolariscrotonis、Bipolariscoffeana、Curvulariaspicifera、Fusariumequiseti、Exserohilumrostratum和Epicoccumsorghinum，其重分离频率为94.9%[26]。(2)环境因素：栽培措施如浇水、施肥的时期、次数等[30-33]以及籽粒灌浆期间的气象因子如温度、湿度、日照长度等也对黑胚率产生较大的影响[18,34-35]。

小麦对不同黑胚病致病菌的抗性不同。CONNER等[36]对7个自然条件下筛选的抗黑胚病小麦品种分别接种A.alternata或B.sorokiniana，所有抗病材料，对A.alternata的抗性都强于感病对照，而只有3个品种对B.sorokiniana黑胚病抗性强于感病对照，同一品种由两种菌引起的黑胚率差异显著，B.sorokiniana引起的黑胚率在品系Fielder和Sinton显著低于A.alternata、而在品系Glenlea显著高于A.alternata。CONNER等[37]用5个硬红粒小麦品种接种B.sorokiniana和A.alternata的研究结果明确了硬红粒小麦对A.alternata和B.sorokiniana黑胚病的抗性不相关，对B.sorokiniana黑胚病与B.sorokiniana根腐病的抗性也不相关。LI等[20]研究结果也显示，小麦对不同黑胚病致病菌的抗性不相关。这些研究结果表明，同一小麦品系对不同黑胚病致病菌的抗性可能有不同的遗传机制。

复杂的影响因素导致同一小麦材料在不同年度、不同地点间黑胚率变化较大，以自然大田条件收获籽粒的黑胚率(自然黑胚率)为依据进行抗性鉴定的结果经常不一致[14,18-21]，给黑胚病抗性遗传研究带来一定的困难。

1.3 抗黑胚病小麦种质筛选研究进展

不同小麦品系对黑胚病的抗性差异明显，黑胚率在0.1% 到79.3%之间[13-14,19-21,36,38-39]，小麦黑胚病的广义遗传力为0.45～0.78[14,17-18]，表明遗传因素对小麦黑胚病抗性有较大贡献。许多学者以自然黑胚率为依据开展了抗黑胚病小麦种质的筛选。王会伟等[13]于2003—2005年对河南省生产上大面积推广和新选育的44个小麦品种(系)的黑胚病抗性进行调查，筛选出豫优1号、陕 229 等6个抗黑胚病小麦品系,占供试材料的13 .6%。LI等[14]对郑州市种植的403份小麦品系进行连续3 a(2010—2012)的调查，筛选出山农4143、西农979-5等36份高抗黑胚病小麦品系，占供试材料的8.9%。CONNER 等[37]报道了SWS21与 Bliss等3份抗黑胚病软白春小麦品种(Soft white spring wheat)，这些抗病品种为小麦黑胚病抗性遗传研究与抗病育种提供了宝贵的资源。但是，这些抗病小麦种质大部分是以自然黑胚率为基础筛选的，其抗病表型可能是环境中菌源不足或环境因素不利于产生黑胚症状的结果，有待于创造适宜发病环境条件进行接菌鉴定的验证。

目前，较少见到通过接菌鉴定筛选抗黑胚病小麦材料的报道。从2010年开始，国家小麦工程技术研究中心小麦遗传育种课题组开始小麦黑胚病的研究，首先以自然黑胚率为基础筛选抗、感黑胚病小麦品系[14]，分离鉴定了河南省小麦黑胚病的10个主要致病菌株[26]，建立了小麦黑胚病接菌鉴定的方法，然后以鉴定的致病菌株和确定的鉴定方法，对以自然发病率为基础筛选的抗病品系进行多年的接菌鉴定，从165份自然条件下表现抗病的小麦品系中只鉴定到7份抗B.sorokiniana黑胚病品系[40]，抗病种质的缺乏制约着抗黑胚病小麦育种的发展。

2 小麦黑胚病抗性位点及候选基因检测研究进展

2.1 小麦抗黑胚病位点分析研究

自20世纪30年代小麦黑胚病被报道以来[41]，至21世纪初，各国学者对小麦黑胚病的研究主要集中在致病菌分离[6,8,25-27,29]、危害[2,4-6,14]、影响因素[18,31-35,37,42]、防治[2-3,16]等方面，关于抗性位点的报道很少。2004年，LEHMENSIEK等[43]用2个普通小麦DH群体，即源于Sunco(R)×Tasman(S)的180个株系与源于Cascades (R)×AUS1408 (S)的104个株系，根据自然发病率定位了9个小麦抗黑胚病QTL (quantitative trait locus)，分别位于1D、2A、2B、2D、3D、4A、5A和7A(2)染色上，能解释4%～18%的表型变异。随后，CHRISTOPHER等[44]用源于Batavia (S)×Pelsart (R)的DH群体，TAH等[45]用4个抗黑胚病品系和1个感病品系构建的F2群体验证源于抗病亲本Sunco的QTL位点及其连锁标记的有效性，指出与2B染色体上QTL连锁的SSR(simple sequence repeat)标记gwm319、wmc35、wmc154和gwm501，有望在抗黑胚病育种中得到应用。然而，用上述标记进行分子检测时，会出现假阳性太高或选择率过低的矛盾，即用1～2个标记能检测出70%以上的抗病家系，但假阳性率>50%；用3个标记同时检测，假阳性率<40%，但会有50%以上的抗病家系检测不到[43]，所以在育种中的实用性不大。这可能是该抗病位点的效应小、或者标记与抗病位点连锁距离远等原因造成的。

随着新一代测序技术和芯片技术的成熟，基于单核苷酸(single nucleotide polymorphisms，SNP)多态性的基因分型方法逐步在小麦抗性位点定位中广泛应用[46]，小麦黑胚病抗性遗传研究得到快速发展。

LIU等[17]用源于临麦2号/中892的F6代RIL群体，结合3点3 a的黑胚率与90 K SNP芯片的基因型数据，定位了9个抗黑胚病QTL，分别位于2AL、2BL、3AL、3BL、5AS、6A、7AL (2)和7BS染色体上，可解释3.7%～13.4%的表型变异；2017年，该作者利用90 K与660 K芯片，对10个环境中种植的256个小麦品种进行全基因组关联分析(genome wide association study,GWAS),在1A (2)、2A (2)、2B、3A (2)、3B (4)、3D、4A、4B (2)、5A (3)、5B (3)、6A (2)、6B(2)、6D、7A (6)、7B (2)和7D (3) 共16条染色体上检测到37个抗性位点，解释7.9%～23.1%的表型变异[19,47]。LÜ等[48]2020年以406个小麦品种为材料，结合90 K与660 K芯片的基因型数据与6个环境的自然黑胚率进行GWAS，共检测到76个显著关联位点，分布在小麦所有的染色体上，能解释9.3%～34.9%的表型变异；同时，该作者以源于UC1110/PI610750的F10代RIL群体为材料，定位了3个抗黑胚病QTL,QBP.hau-3A、23QBP.hau-6D与QBP.hau-7D,分别解释了6.8%、7.8%与8.8%的表型变异，结合GWAS与QTL定位结果，其认为QBP.hau-6D是最重要的抗黑胚病新位点。LI等[21]2020年利用101份材料构成的不完全双列杂交群体的55K芯片基因型数据、结合3点2 a接菌鉴定的黑胚率，检测到53个与小麦B.sorokiniana黑胚病显著关联位点，位于1B (3)、1D、2A (3)、2B (3)、2D (3)、3A (3)、3B(4)、3D (2)、4A,4B、4D (3)、5A (5)、5B (3)、5D (2)、6A(2)、6B (4)、6D、7A(4)、7B和7D(4) 共20条染色体上，可解释8.6%～16.2%的表型变异。目前已报道的抗黑胚病位点已多达235个[17,19,21,23,39,43,44-48]。根据GWAS结果分析中常用的连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)衰减距离分析报道的位点[19,21,45]，取普通小麦报道的较大的LD衰减距离为15 Mb[47]，物理位置超过LD衰减距离15 Mb的位点认为是2个不同位点。已报道的194个抗黑胚病位点经分析后为117个位点，分布在小麦所有的21条染色体上，第2、3、5同源群染色体上的抗性位点最多，分别有22、19与20个，第1同源群染色体上的最少，为12个，A、B、D基因组分别有36、45与36个位点(表1)。

125个位点中(表1)，在3个及以上研究中被同时检测到的有24个，位于2A、2B(3)、2D、3A、3B(3)、4A、5A(2)、5B(3)、6A(2)、6B(2)、7A(2)、7B与7D(2)共13条染色体上，其中有7个位点在3个以上研究中的贡献率大于10%，分别是2A(707.0～774.9 Mb)、3A(682.2～743.5 Mb)、3B (18.8～62.1 Mb)、3B (691.4～773.9 Mb)、6A (5.8～94.2 Mb)、7A (609.5～720.8 Mb)、7B (729.2～730.1 Mb)，特别是2A与6A上的位点在所有的5个及以上研究中均被检测到[17,19,21,39,47-48]。这7个稳定存在、贡献率较大的位点可能在抗黑胚病遗传中发挥着重要作用，但是其抗病效应尚不明确。

表1 小麦抗黑胚病位点Table 1 Reported loci associated with resistance to black point in wheat

续表 Continuing table

续表 Continuing table

2.2 小麦抗黑胚病候选基因分析研究

将与黑胚病抗性显著关联SNP(single nudeotide polymorphism)标记的探针(侧翼)序列，在NCBI (the National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和ENA (European Nucleotide Arvhive,http://www.ebi.ac.uk/ena)数据库中进行BLASTn和BLASTx，可以检索与黑胚病抗性相关的候选基因[17,19,21]。

LIU等[17]将9个黑胚病抗性QTL连锁标记的探针序列在NCBI和ENA数据库中检索，筛选到3个候选基因，即过氧化物酶生物合成蛋白 (peroxidase biosynthesizes protein)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体(serine/threonine-protein kinase receptor)与编码MYB转录因子SM153-1的MYB基因；该作者也对GWAS分析中与黑胚病抗性关联SNP的探针序列进行检索，发掘到7个候选基因[19,47]。LI等[21]通过该方法筛选到3个黑胚病抗性候选基因。除上述3个基因外，还有多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)、F-box蛋白(F-box proten)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase)、锌指结构蛋白(zinc finger protein)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、赤霉素生物合成(gibberellin biosynthetic process)、U-box结构域蛋白(U-box domain-containing protein) 基因等。最近，LIU等[52]将3B染色体上的QTLQBp.caas3BL精细定位到1.7 Mb的物理区间，包含5个候选基因(TraesCS3B02G404300,TraesCS3B02G404400,TraesCS3B02G404500,TraesCS3B02G404600与TraesCS3B02G404700)，其中前4个是与ABI5(abscisic acid-insensitive 5)同源的bZIP家族的转录因子，而TraesCS3B02G404700是蛋白磷酸酶(protein phosphatase)基因的同源物。

已报道的这些抗黑胚病候选基因按照功能基本上分为3类：1)与酚类化合物的氧化有关，主要包括过氧化物酶体生物合成蛋白、POD与PPO。在植物体内，POD与PPO催化酚类底物形成醌类化合物，醌类转化为黑色素等黑变物质[53-55]。这是目前黑胚病症状形成的主要机制，即通过酶促褐变形成植物黑色素从而产生黑胚症状[56-57]，所以，这类候选基因与小麦黑胚病的症状形成相关。2)与植物激素信号转导相关，主要包括赤霉素(gibberellin,GA)生物合成、F-box、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体基因。GA参与调节植物生长过程遭受胁迫后的抗逆应答途径，可能通过调控成熟前的穗发芽影响黑胚病的形成，而F-box蛋白可以调节GA的信号转导[58-59]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶通过参与外界环境信号的感知和传导，触发应对非生物和生物胁迫的多种生理生化反应，在植物遭受外界胁迫后的应答过程中起着重要作用，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体配合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶完成信号的转导[60-61]。由此类基因功能推测，小麦黑胚病抗性与GA介导的植物信号传导相关。3)与植物受到真菌侵染后的防御机制有关，如锌指结构蛋白、U-box结构域蛋白、MYB转录因子等。锌指结构蛋白是逆境转录因子的基本结构，其被干扰或过量表达后，可显著降低或增强植物的抗逆性[62-63]。U-box结构域蛋白具有E3泛素连接酶活性[64]，在烟草和番茄中参与应对真菌侵染的防御机制[65]。MYB转录因子是植物体内一类多功能蛋白家族，在植物遭受如病菌侵染等生物胁迫和高温、干旱等非生物胁迫后的应答调控中发挥重要作用[66-67]。ABE等[68]认为，该转录因子可以通过调节POD基因的表达，间接调控酚类化合物氧化还原速率，从而影响黑胚症状的形成。在籽粒发育过程中，由于病原菌侵染等生物胁迫或者干旱、高温等非生物胁迫引起小麦籽粒内部活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量增加，抗病小麦种质能够通过抗氧化酶活性增强等途径及时清除过量的ROS、而感病小麦种质由于抗胁迫相关的蛋白含量较低[69]，不能及时清除过量的ROS，导致膜系统受损使POD或PPO与底物接触而引起酶促褐变[56,70]。小麦黑胚病抗性与胁迫应对能力和酶促褐变过程相关，涉及诸多的生理生化机制。这些候选基因在小麦抗黑胚病中的作用还需进一步的研究确认。

3 小麦抗黑胚病遗传研究的思考

3.1 分子标记缺乏制约着黑胚病抗性育种的发展

普通小麦中国春测序计划的完成(https://urgi.versailles.inra.fr/jbrowseiwgsc/gmod_jbrowse/?data=my Data%2FIWGSC_RefSeq_v1.0，IWGSC)，新一代测序技术和芯片技术的成熟，为小麦黑胚病抗性位点研究奠定了良好的基础。利用分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)技术，把抗病QTL/基因转育到高产品种中以培育抗病新品种是控制小麦黑胚病的有效途径[3,14,21,42]。黑胚病在小麦籽粒灌浆形成，其接菌鉴定在开花后进行[38]，鉴定结果在收获脱粒后才能看到，不仅持续时间长，程序复杂，而且当年的鉴定结果只能指导下一年的杂交组合配置。在表型鉴定费时、烦琐、结果又不太稳定的情况下，MAS在黑胚病抗性育种中更为重要，能够减轻工作量、有效促进抗病育种进程。然而，自从20世纪30年代黑胚病被报道以来[41]，受多种因素的影响，尤其是受其表型鉴定费时费力且结果不稳定的制约，黑胚病的抗性位点研究相对缓慢，至今也没有育种中可用的分子标记的报道，这种现状严重制约着小麦抗黑胚病育种进程，急需实用的分子标记用于MAS。

3.2 主效抗黑胚病位点不明确制约实用分子标记的开发

小麦黑胚病抗性是复杂的数量性状，虽然已报道的抗病位点多达230多个，且多数位点具有显著的加性效应[17,19,21,46-47]，但是位点很分散，每条染色体上都有、每个位点的贡献率都不高，聚合6～8个抗性位点时，才能有较高水平的抗性(黑胚率<15%)[19]，这种现状给抗黑胚病小麦新品种选育带来不小的困难。所以，应加强小麦抗黑胚病主效位点效应分析。针对这个问题，在黑胚病抗性位点研究中应关注以下3个方面：

1)选准亲本、准确鉴定表型。如前所述，因为受致病菌与环境的双重影响，以自然发病率为依据筛选的抗病材料的真实性有待接菌鉴定的验证，若以此为试验材料进行黑胚病抗性位点的定位研究得出的结果也未必可靠。所以，首先，应该明确本地区小麦黑胚病的主要致病菌，然后通过接菌鉴定的方法筛选真正的抗病亲本；其次，要采取可靠、可行的黑胚病抗性鉴定方法，如“孢子液喷洒、套袋保湿”的方法[71]对亲本及遗传群体进行表型鉴定。最后以接菌鉴定的抗、感黑胚病小麦材料为亲本，构建遗传分离群体并进行接菌鉴定，以获取准确的表型数据，为抗性位点的定位奠定良好的基础。

2)针对特定病原菌、定位主效QTL。小麦黑胚病致病菌复杂，由于存在寄主—病原互作，小麦对不同病原菌引起的黑胚病的抗性机制不一样[20,25,36-37]，如果仅在自然条件下进行黑胚率调查来进行QTL定位，可能结果不可靠且得不到效应较大的QTL。目前，国内外对小麦黑胚病抗性位点研究的最大不足可能正是不针对特定病原菌、不进行接菌鉴定表型的条件下开展笼统的定位研究[19,41,46-47]。小麦黑胚病的抗性研究应该针对不同的病原菌、尤其是A.alternata、B.sorokiniana等优势病原菌开展研究，以定位针对不同病原菌的主效QTL,并且构建近等基因系等遗传群体对主效QTL的抗病效应进行分析，然后在育种中通过MAS技术，将抗不同病原菌的主效QTL聚合在同一农艺亲本中，培育抗多种病原菌的品系，这样的抗病品系才能在不同的地点不同年度间维持稳定的抗病性。

3)结合不同方法优势、加快抗性遗传研究进程。复杂数量性状QTL定位是植物遗传学研究的难题，基于双亲群体的连锁分析与基于自然群体的GWAS是目前抗性位点定位的2种主要方法，此外，集群分离分析法(bulked segregant analysis，BSA)也逐渐的应用于小麦抗病位点的定位研究，BSR-Seq是BSA与转录组测序(RNA-Seq)技术结合的快速标记开发和基因定位的有效方法[72]。GWAS利用多样的自然群体，遗传变异丰富，可短时间内发掘更多的关联位点，且分辨率较高；然而，对于群体中稀有等位基因位点没有检测效力，对微效位点的检测效力有限。连锁分析可以定位到微效QTL，也直接用于发展精细定位群体；然而，双亲分离群体构建时间较长，QTL受到双亲遗传多样性及是否分离的限制，一般初定位精度有限。BSA法不需要对每个单株/家系进行基因分型，节约成本，可快速定位并检测出紧密连锁的标记；但是，该方法的准确性受群体遗传背景、样品数量、标记类型、分析方法和表型鉴定准确度等因素影响[46]。在小麦对黑胚病抗性位点的研究中，可以结合不同方法，更快、更准确地定位稳定遗传的主效位点，并开发实用的分子标记，以促进抗黑胚病小麦育种进程。