细针穿刺细胞块技术联合免疫组化在腮腺肿瘤诊断中的应用

杨英来 赵建广 陈 赫 崔子峰

腮腺区的疾病构成广泛，临床表现多样，位置特殊，对颌面部功能、美观及心理要求高，但其术前禁忌行病理活检，病理类型复杂，鉴别困难，因此腮腺病变最初的诊断策略对明确诊断及治疗方案的制订显得尤为重要[1]。目前在临床工作中术前较多应用影像学和细针吸取细胞学诊断来评估肿瘤，而FNAC是基于对细胞、细胞群或组织微粒评估的一种简捷、准确的细胞学诊断方法，尽管分子发病机制多样且生物学行为各不相同，但许多不同的腮腺肿瘤通常在细胞学上相似，这使得FNAC对鉴别腮腺肿瘤的价值存在争议[2]。另外肿瘤标记物也能提高诊断的准确性，因此本研究拟评估FNAC在腮腺肿瘤中的诊断特性并联合利用GFAP、Fas-FasL免疫组化以评估其诊断价值。

资料和方法

1.材料

回顾河北医科大学第四医院口腔颌面外科2014年9月至2019年6月期间的腮腺肿瘤患者383例。入组标准：①具有完善的病例资料，包括性别、年龄、术前FNAC及术后组织病理学诊断报告；②FNAC均在超声引导下完成，除送细胞学检测外还将剩余样本按照本研究方法成功制作细胞块；③FNAC及术后组织病理学诊断均分别由我院细胞学室及病理科2名以上专职医师完成。

2.方法

（1）超声引导下穿刺：经超声探查、定位肿瘤，用20ml注射器配6号针头，于定位点引导下经皮刺入腮腺肿瘤内，拉针栓维持负压不出针在4～5个不同方向提插，直至获得足够的样本，除3～4张用于传统细胞涂片送细胞学室检测外，保留足够样本用于制作细胞块。

（2）细胞块制作：将穿刺出的组织或液体附于载玻片上，在竖起载玻片不流动的情况浸入95%乙醇中0.5～1.0min，取出后用穿刺针将样本集聚成小块状，再浸入10%中性甲醛溶液中30～60min，擦镜纸包裹固定后的样本放入脱水盒，后续按照活检小标本方法常规行脱水、透明、浸蜡，最终完成石蜡包埋。

（3）免疫组织化学检测兔抗人胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体浓缩液GFAP，鼠抗人Fas单克隆抗体、兔抗人FasL多克隆抗体Fas-FasL蛋白检测试剂盒购置于中杉金桥（北京）公司。对FNAC细胞块行免疫组化，用已知阳性组织作为阳性对照，以PBS代替一抗作为空白对照。

（4）统计学处理：采用SPSS26.0统计学软件进行数据分析，Kappa一致性检验用于比较术前FNAC和术后组织病理学诊断，组间阳性率比较采用χ2检验（包括连续校正法和Fisher确切概率法，两两比较使用卡方分割法），P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.在383例病例中，36例因病例资料不完善或FNAC样本未成功制作成细胞块而被排除。对347例纳入研究的病例进行分析，其中男性198例（57.06%），女性149例（42.94%），平均年龄为53.10±13.47岁（范围：6～83岁）。术前FNAC中疑似恶性或恶性68例，良性279例；术后组织病理学诊断中恶性52例，良性295例，其中最多见的恶性肿瘤为ACC（19/347，5.48%），最多见的良性肿瘤为PA（193/347，55.62%）。

2.FNAC对腮腺恶性肿瘤诊断的阳性预测值为57.35%，阴性预测值为95.34%，灵敏性为75.00%，特异性为90.17%，对研究例病例诊断的准确率为87.90%，FNAC与组织病理学诊断有中等一致性（Kappa＝0.578）。假阴性、假阳性诊断较多出现于ACC与PA中（表1～3）。

表1 FNAC与组织病理学诊断结果对比

3.除外3例淋巴瘤，总共有16例腮腺ACC具有足够的细胞块样本，选取同样条件的PA 37例，腮腺正常组织块37例，共90例行GFAP，Fas及FasL免疫组化（表4、5）。

表4 Fas及FasL表达结果及统计分析

Fas及FasL：37例组织学诊断为正常腮腺组织的标本经免疫组化学染色后，36例显示阳性，1例为阴性；37PA例组织学诊断为的标本经免疫组织化学染色后，34例显示阳性，3例为阴性；16ACC例组织学诊断为的标本经免疫组化染色后，16例均显示阴性。通过检验，三组中的表达差异有统计学意义，（对Fas-fasl，差异分析P值小于0.05，说明三组间的检验结果差异具有统计学意义；经卡方分割法两两比较可知；正常组别与PA相比（χ2＝0.264，P＝0.607＞0.017），正常组阳性率与PA组差异无统计学意义；正常组与ACC组相比（χ2＝48.534，P＝0.001＜0.017），正常组阳性率与ACC组差异具有统计学意义，正常组阳性率高于ACC组；ACC组别与PA相比（χ2＝40.013，P＝0.001＜0.017），ACC组阳性率低于PA组）。

表2 假阴性病例的FNAC和组织病理学诊断

表3 假阳性病例的FNAC和组织病理学诊断

GFAP：37例组织学诊断为正常腮腺组织的标本经免疫组化学染色后，35例显示阴性，2例为阳性；37PA例组织学诊断为的标本经免疫组织化学染色后，37例显示阳性，3例为阴性；16ACC例组织学诊断为的标本经免疫组化染色后，16例均显示阴性。通过检验，在三组中的表达差异有统计学意义。

表5 GFAP表达结果及统计分析

图1 、2 免疫组化：正常腮腺、AP中Fas及FasL阳性表达（ ×200 ×400）

图3 、4 免疫组化：AP中GFAP阳性表达（ ×200 ×400）

讨 论

涎腺肿瘤约80%发生在腮腺。涎腺肿瘤的主要治疗方式是外科手术切除，良恶性肿瘤的手术方式和手术范围不同，治疗方案主要取决于肿瘤的组织学类型，这就对腮腺肿瘤的术前诊断提出了挑战[1]。考虑腮腺本身的生理功能、腮腺中与腮腺床上重要的神经血管以及腮腺肿瘤的特异性，在临床实践中几乎被视为禁忌。因此术前鉴别涎腺肿瘤的良恶性在制定手术计划中起着重要的作用。由于涎腺肿瘤在早期缺乏特异性症状和体征，术前在临床上难以确定其性质，在临床工作中术前较多应用CT、MRI、超声等影像学来评估肿瘤[2]。

FNAC已较广泛的应用于甲状腺肿瘤，乳腺肿瘤等；在涎腺肿瘤中，研究显示:与涎腺检查和放射学评估相比，FNAC被认为对涎腺肿瘤具有更高的诊断准确性[3]。但也有部分学者研究表明，尽管它在近1/3的病例中消除了手术治疗的可能性，但由于其敏感性低和细胞学活检结果的差异，其临床益处仍然受到质疑[4]。部分学者认为术前行FNAC是不必要的，无论FNAC结果的准确性如何，即便可能出现的假阳性和假阴性结果，其均需手术治疗，因此不需要术前行FNAC；但是由于良性腮腺肿瘤和恶性腮腺肿瘤的手术方案的选择具有差异，所以有相当多的研究者主张术前对于腮腺肿瘤患者行FNAC的是必要的[5]。与传统FNAC相比较，超声引导下的FNAC的适应证更广：①传统FNAC不能成功穿刺的肿块，如直径＞1cm但不能触及的肿块；②肿块可触及但直径＜1cm；③深部腮腺区肿块；④邻近血管或神经的肿块；⑤囊性或混合性肿块。虽然超声引导下穿刺活检能够获取较多的组织，但对腮腺肿瘤的生物学行为、恶性程度及预后的研究多从病理形态学的角度研究。受观察人员的主观因素影响而不能全面准确的指导临床治疗措施及肿瘤预后的效果[2，6]。所以寻求从分子生物学角度研究腮腺肿瘤的性质和转归，可以准确的筛选具有高复发、高转移潜能的肿瘤患者，从而能够制定合理的治疗方案和临床用药。另外近年来，细胞蜡块免疫组化检查是一种介于涂片细胞学和病理组织学之间的一种有效的临床诊断方法，利用细针穿刺标本呈现局部组织病理学形态，细胞蜡块切片中细胞数量丰富而且相对集中，为进行免疫组织化学染色后分子病理学检测提供了良好的样本平台。

通过超声引导下穿刺而制成的细胞块具有如下优点：①细胞块切片能保持部分原有组织的排列结构，细胞成分丰富，图像背景清晰，易于作出准确诊断；②切片的细胞集中，克服了传统穿刺涂片中细胞重叠堆积、厚薄不均的现象；③细胞块可连续切片，能有效减少漏诊；④可反复重切，克服传统穿刺涂片固定不佳、脱片、染色失败等难以弥补的缺陷；⑤能作多种组织化学染色、免疫组织化学染色或分子病理学检测[2，7]。但是通过该方法制作的细胞块也有一定的局限性，在穿刺吸出物极少时难以完成。

本研究应用细针穿刺细胞技术联合免疫组化，试图找到一个能够确切地区别幵的标记物，将会是解决这些诊断难题和选择正确治疗方法的关键。经过大量的文献阅读，慎重筛选后得出的标记物。应用GFAP（胶质纤维酸性蛋白）和Fas及FasL对细胞块制备后进行免疫组织染色[8，9]，我们本次试验结果显示GFAP和Fas及FasL在在三组中的表达差异有统计学意义。运用组织块标本来评估将作为诊断的一个辅助工具。

随着分子诊断技术的进步，有关涎腺肿块分子标志物检测的研究不断深入，对于涎腺肿块的诊断、预后甚至选择合适的治疗方案均具有重要作用[1]。但是目前分子诊断技术多应用于手术后涎腺肿块的诊断，不能进行早期诊断。本研究发现，在超声引导下行腮腺组织FNAC并制作成细胞块，结合分子标志物检测，能早期诊断涎腺肿块，具有操作简便，创伤小，并发症少的优点，可以避免不必要的手术，在腮腺区肿块诊断方面具有重要意义。

经过本研究：在多形性腺瘤中的阳性表达以及在腺样囊性癌中的无表达可以更加准确的区分这两种在腮腺中常见的良、恶性肿瘤；能否寻求到新的，更加有效的鉴别肿瘤的指标，还有待进一步探究。