雷公藤多苷抗大鼠实验性牙周炎的研究

任百洁 姚红英

牙周炎（periodontitis）是由多种因素导致的慢性破坏性疾病，同时也是发病率最高的口腔感染性疾病之一[1]。第四次口腔流行病学调查结果显示我国80%～96%的成年人有不同程度的牙周问题[2]。由此可见，牙周炎已成为影响成年人口腔健康的首要原因。目前研究观点认为，牙菌斑及其产物的直接破坏途径和宿主免疫反应所造成的间接破坏途径是造成牙周炎发生发展的两大主要途径[3]。因此使用药物调节免疫炎症反应是治疗牙周炎的关键之一。与抗生素相比，中草药因其毒副作用小、药理作用丰富得到了学者们的重视。提取中草药中有效成分用以治疗牙周疾病已成为现代研究的热点。

雷公藤多苷（tripterygium wilfordii polyglycosides，TWP）是从传统中药-雷公藤根部提取而来的一种糖苷，其主要成分是环氧二萜内酯[4]。现代药理研究表明，雷公藤多苷对T淋巴细胞有明显的抑制作用，对自身免疫有调节作用[5]。利用雷公藤多苷免疫调节的作用，临床上已将其用来治疗类风湿性关节炎，甲状腺炎等疾病[6，7]。但目前尚未查到关于雷公藤多苷用以治疗牙周疾病的报道。本研究通过丝线结扎建立大鼠实验性牙周炎模型，局部注射雷公藤多苷，探讨其对大鼠实验性牙周炎的抑制作用及其可能的机制，为临床治疗牙周疾病提供依据。

资料和方法

1.主要实验材料与仪器设备：福尔马林、氢氧化钠、盐酸、PBS缓冲液（北京化工厂，中国）；水合氯醛（原叶生物科技有限公司，上海）；Trizol（Magen，中国）；反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒（Takara，日本）；Cr、ALT、AST检测试剂盒（南京建成科技有限公司，中国）；包埋机（TB-718E，英国）；石蜡切片机（FINESSE325，英国）；PCR仪（Thermo，美国）。

2.动物选取及实验分组：选取24只雄性、6周龄的SD（Sprague Dawley）大鼠，体重范围为220～250g。在12:12h的明/暗周期，24°C±2°C的环境下饲养大鼠，所有大鼠的饮食和饮水保持一致性。本实验通过了江苏省伦理委员会审查。经过一周的适应性喂养（符合上述所有条件）后，除空白对照组的大鼠外，对所有大鼠进行丝线结扎，将它们随机分为4组（n＝6）：①空白对照组（称为“NL”）；②结扎对照组（称为“LC”）；③结扎+生理盐水组（称为“L+NaCl”）；④结扎+雷公藤多苷组（称为“L+TWP”），于尾部进行分组标记（图1.A）。

图1 雷公藤多苷给药对大鼠一般情况及肝肾功能的影响

3.大鼠实验性牙周炎模型的建立及给药处理：大鼠实验性牙周炎模型建立方法如下：实验前一晚禁食不禁水，通过腹腔内注射10%水合氯醛（当天配置，避光保存）麻醉大鼠（0.35μL/100g剂量注射），自制扩口器辅助张口，完全暴露双侧上颌第一磨牙，并使用牙龈分离器分离牙龈。用丝线将磨牙结扎一圈，确保丝线位于牙龈沟内。L+TWP组及L+NaCl组分别于大鼠牙龈注射1mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷和等体积的生理盐水。

4.临床指标检测及取材：注射给药1周后，检测各组大鼠简化软垢指数（debris index simplified，DIS）及龈沟出血指数（sulcus bleeding index，SBI）（具体检测方法参照[8，9]，结果记录评分标准如表1及表2）；去除软垢后，使用尖端直径为0.3毫米的圆头探针测量探诊深度（probing depth，PD），记号笔标记探诊探入末端，使用游标卡尺精确记录数值，最后进一步检测计算临床附着丧失水平（clinical attachment level，CAL）（具体检测方法参照[10]）。对腭侧近中、远中和中央三个进行评分，并计算平均值。处死大鼠，快速分离目标牙的牙龈组织，标准选取为：横向距离为目标牙的近远中距离，宽度约为龈方2mm，每组随机取3只置于-80℃冰箱中保存，另3只于福尔马林固定并同时取其肝脏组织同样进行固定；亚甲蓝染色骨组织观察骨吸收情况。

表1 DIS评分标准

表2 SBI评分标准

5.生化指标检测：各组大鼠取其动脉血，参照相应试剂盒检测方法检测血清中肌酐（creatinine，Cr）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

6.qRT-PCR检测牙周组织相关炎症因子：根据Takara试剂盒说明对大鼠牙龈组织进行qRT-PCR检测，得到相应OD值进行统计分析。PCR引物序列为：β-Actin：F-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，R-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG；IL-6：FAAGCCAGAGCTGCAGGATGAGTA，R-TGTCCTGCAGCCACTGGTTC；TNF-α：F-TTCCAATGGGCTTTCGGAAC，R-AGACATCTTCAGCAGCCTTGTGAG；IL-1β：F-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA，RCCCAAGTCAAGGGCTTGGAA。

7.组织学分析：取出置于福尔马林中的大鼠牙龈组织和肝脏组织，流动水冲洗1h，修整组织后常规梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，切片厚度为4mm，伊木精-苏红染色后，光学显微镜下观察牙龈组织和肝脏组织的病理变化。

8.统计学分析：所有数据均采用GraphPad Prism 7.00统计软件进行统计分析。通过卡方检验和Student t检验进行比较。实验结果表示为平均值±标准偏差，P＜0.05被认为具有统计学意义。

结 果

1.大鼠一般情况及肝脏HE染色结果：给药组大鼠和其余三组大鼠一般情况无差异，体型及代谢正常，体重稳定增长，毛发光泽且活动敏捷。肝脏HE染色显示：各组大鼠的肝索结构正常，肝细胞的形态没有变化，未见炎细胞浸润。血清生化检测显示：各组大鼠血清AST、ALT、Cr水平无统计学差异（P＞0.05）。

2.实验性牙周炎大鼠临床指标检测结果：第7天，对每组大鼠进行口腔检查以评估其牙周炎症和药物的抗炎作用，并测量DIS、SBI、PD及CAL值。上颌第一磨牙的口腔内临床检查显示，结扎日（时间0）7天后，结扎组的牙龈颜色，质地和形态与NL组不同，表现为大量的黄色软垢附着在结扎丝线上，完全覆盖了牙齿表面（图2A）；去除这种软垢后，牙龈显示出炎症，水肿，颜色变化和龈沟出血，牙周探诊探诊龈沟后，可见牙龈出血，溢出龈沟（图2B）。LC组的DIS，SBI的变化显著高于NL组（P＜0.05）。与LC组相比，L+NaCl及L+TWP组的DIS没有观察到显著差异（P＞0.05）。L+NaCl与L+TWP组的SBI比较，发现有显著差异（P＜0.05）（表3）。LC组的牙周袋深度和附着丧失水平与NL组相比显著增加（P＜0.05）。与此同时，L+TWP组与L+NaCl组比较，PD及CAL值显著降低（P＜0.05）（表3）。

图2 牙周炎建模示意图及牙周临床指标检查图

表3 各组牙周临床指标比较

3.qRT-PCR检测结果：LC组中3个促炎细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-αmRNA的表达量与NL比较均有显著性差异（P＜0.05），且分别比NL组高约7.31，75.04和5.03倍。与L+NaCl组相比，L+TWP组中的IL-1β，IL-6和TNF-αmRNA表达显著降低（P＜0.05）（图3）。

图3 雷公藤多苷对大鼠牙龈组织中IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA表达的影响

4.牙龈及骨组织观察结果：NL组的组织切片中观察到正常的牙龈组织结构，组织中未发现炎性细胞浸润（图4A）。LC组及L+NaCl组的切片见牙龈结缔组织内大量的中性粒细胞，淋巴细胞和浆细胞等炎症细胞（图4B，C）。L+雷公藤多苷组的牙龈组织接近正常组，炎症反应几乎消失（图4D）。与HE染色结果相似，L+雷公藤多苷组的骨组织吸收程度明显低于LC组及L+NaCl组（图4E-G）。

图4 牙龈HE切片及单侧上颌骨组织染色图

讨 论

本研究主要对雷公藤多苷抑制大鼠实验性牙周炎的作用效果进行观察，并进一步分析其作用机制。

牙龈炎是牙周炎的早期症状，牙周探诊出血是临床诊断牙龈炎的金标准。本实验对大鼠双侧上颌第一磨牙进行丝线结扎处理，对其DIS、SBI、PD及CAL进行检测，结果表明结扎构建的炎症环境是相同的，在相同软垢刺激的条件下，雷公藤多苷组的牙龈炎症明显缓解，提示雷公藤多苷具有抑制牙龈炎症的功能。我们在牙龈组织切片及亚甲蓝染色的上颌组织中观察到了相同的抗炎效果：应用雷公藤多苷实现了局部微环境中炎症的抑制。

牙周炎是多种因素造成的炎性感染性疾病，细胞因子（IL-1β，IL-6和TNF-α等）介导的免疫炎症反应是导致牙周炎症进一步发展的重要因素[11～13]。目前有效的牙周治疗手段包括牙周洁治刮治、翻瓣术、引导性骨组织再生术等主要致力于消除菌斑，忽视了针对免疫炎症反应的干预，故治疗效果总是差强人意。针对炎症较重的牙周病患者，临床常辅以药物治疗。但现今临床上治疗牙周炎的药物主要以抗生素为主，长期应用易产生耐药菌和胃肠道反应等副作用，因此副作用小的中药提取物具有临床研究意义。药理研究显示[14]，雷公藤多苷具有抗炎、免疫抑制和抗肿瘤等多方面的功能。艾燕等[15～17]研究表明，雷公藤多苷可通过抑制TNF-α及IL-1β等促炎细胞因子水平实现治疗类风湿性关节炎，结肠炎及肾炎等疾病。我们对大鼠牙龈组织进行qRTPCR检测，结果显示雷公藤多苷可以抑制IL-1β，IL-6和TNF-α的表达，从而对牙周组织炎症产生积极而有效的对抗及治疗作用。因此，雷公藤多苷可能成为抑制牙周炎的有效药物。但是相对于雷公藤多苷的副作用[18]，其用于牙周治疗带来的益处是否足以支持其作为牙周治疗用药呢？研究发现，雷公藤药物的最大安全剂量为40g·d-1[19]。Sen等[20]使用12mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷对大鼠进行灌胃后，对其血清ALT和AST进行检测，发现与正常对照组无统计学差异。我们的实验再次验证了该说法，给药组大鼠与其他大鼠血清中Cr、AST和ALT的检测结果无统计学差异。此外，Feng等[21]研究发现，小剂量使用雷公藤多苷甚至可通过肾脏代谢和抗炎作用改善肾功能和结构改变。可见在合理范围内使用雷公藤多苷并无毒副作用。本实验药物使用剂量为1mg·kg-1·d-1，远远小于安全剂量，因此本实验使用的药物剂量对大鼠相对安全。

综上所述，雷公藤多苷的应用可以抑制牙龈组织炎症及骨吸收的发生发展，这与其调控多种炎症细胞因子表达有关，提示雷公藤多苷可以作为牙周炎早期治疗的潜在辅助用药。雷公藤多苷的应用既可以弥补传统治疗的不足，强化宿主炎症的抑制，又不易产生毒副作用，且药理作用丰富，因此应用雷公藤多苷治疗牙周炎具有研发意义。但应用于临床，还需更多的实验数据对其抑制骨吸收的作用机制及肝肾损伤等做更为深入的实验研究。