乌龙茶做青工艺中萜类挥发性香气形成机制研究进展

邢家宝 曹藩荣

（华南农业大学园艺学院，广东广州，510642）

1 前言

乌龙茶隶属于我国六大茶类，因具有独特的加工工艺、绿叶红镶边的外观特征、醇厚甘爽的滋味以及馥郁芬芳的香气而深受国内外消费者喜爱和青睐。乌龙茶的独特风味品质的形成与其加工工艺密切相关，其加工流程为：鲜叶采摘→萎凋→做青（摇青、晾青结合）→杀青→揉捻→干燥。而在加工工艺中，鲜叶采摘后经过适当机械损伤和走水（水分胁迫）而引发茶叶内含物质发生转化、香气成分逐渐显现的过程被称之为做青，也是形成乌龙茶独特品质的关键加工工艺。但是在实际制茶中不同茶树品种乌龙茶做青工艺时间以及水分把握都不尽相同，部分制茶师通过“醒香”、“闻香”来把握和变换晾青的时间以及制茶环境温湿度，以达到最佳乌龙茶品质。

香气，又名风味物质，是茶叶感官审评的重要因素，也是衡定乌龙茶品质的重要部分。虽然香气在茶叶中其生化成分含量很低，但其物质种类繁多。具体哪些香气物质在乌龙茶香型中占比较多，香气物质在鲜叶采摘后加工过程中是如何转化的以及部分香气物质形成机制，一直都是目前茶学基础研究中的热门话题。目前比较清楚的茶叶香气形成途径主要有五种：（1）萜类香气合成途径；（2）类胡萝卜素氧化降解途径；（3）脂肪酸过氧化及降解途径；（4）糖苷水解途径；（5）儿茶素类氧化途径[1]。其中萜类香气合成途径与茶叶加工密切相关，在茶叶加工过程中，非生物胁迫一直伴随其中。茶叶在采摘后保持生命活性通过一系列生理反应形成自我保护来减少或者抗衡胁迫的伤害，从而不仅影响了茶叶的外观品质还会诱导茶叶产生大量香气物质[2]。萜类香气物质作为茶叶香气的前体物质，其中的部分在乌龙茶香气中占比较大，很大程度上左右茶叶的风味品质。茶树萜类合成代谢途径的研究也多，茶叶香气特点和加工胁迫处理与萜类挥发性香气合成途径之间的关系有清晰明确的认识，也为以后选育抗逆高香品种以及揭示部分萜类挥发性香气生成的关键基因提供了参考和借鉴[3]。

2 萜类挥发性香气物质的研究概况

2.1 萜类物质与乌龙茶香气

萜类物质，是茶树次生代谢产物。萜类物质根据碳原子数目或者异戊二烯基本结构单位个数可分为半萜、单萜、倍半萜、二萜、四萜等（图1）[1,3,4,5,6,7,8]。又根据是否具有挥发性，可分为高萜与低萜，低萜就是萜类挥发性香气物质VTs，即半萜、单萜和倍半萜，是构成茶叶香气的重要物质基础，也是构成茶叶花果香香型的重要来源之一。有研究表明，低萜即萜类挥发性香气物质与乌龙茶香气形成密不可分，陈林和王赞等[9,10]都研究表明，吲哚、苯乙醛和低萜中的反式-橙花叔醇这些香气组分形成乌龙茶的花果香型，可作为乌龙茶做青工艺把握品质的主要化学评测指标；刘彬彬等[11]从多种乌龙茶成品中分离鉴定出主要挥发性芳香物质都有芳樟醇及其氧化物、橙花叔醇、a-法尼烯、吲哚、β-紫罗酮、茉莉酸甲酯等，乌龙茶主要香气成分中包含萜类香气物质；王梦琪等[12]通过比较不同类型乌龙茶中鉴定出的关键呈香成分，发现橙花叔醇、芳樟醇及其氧化物以及α-法尼烯是普遍存在于乌龙茶中的关键呈香成分，且橙花叔醇是福建乌龙茶品种最主要的香气成分，具有花香及果香特征。不同类型乌龙茶所选取制茶原料的茶树品种不同，加工工艺各阶段时间把握也不尽相同，最终乌龙茶中关键呈香成分趋于相同，且都为萜类香气物质，因此，萜类香气物质是构成乌龙茶品质的重要影响因素。二萜及以上的萜类化合物一般并不具有挥发性，被称之为高萜，不少高萜比较常见，在植物生长代谢中担任重要角色，例如二萜物质赤霉素GA，作为植物激素，最突出的生理效应是促进茎的伸长和诱导长日植物在短日条件下抽薹开花；多萜物质泛醌，又称辅酶Q（CoQ），是呼吸链中重要的非蛋白类辅酶，是呼吸链中的氢传递体，参与电子传递[3]。部分高萜作为维持细胞生命活动所必需的基本代谢底物和促进代谢成分，也对乌龙茶加工过程中香气释放有重要贡献，例如四萜物质类胡萝卜素，不仅作为叶绿体中的两种色素，吸收和传递光能以及保护叶绿素，还可作为类胡萝卜素氧化降解香气途径的前体物质，通过萜类香气合成途径代谢生成的多萜物质类胡萝卜素可再次降解形成相对稳定的芳香物质如β-紫罗兰酮，具有甜而浓重的花香[5,6]。

图1 茶树主要萜类化合物[1]

1.2 萜类物质的形成（MVA途径、MEP途径）

萜类香气的合成离不开两条重要途径，即甲羟戊酸途径（MVA）和甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径（MEP）[4,6,7,8]。其中MVA途径主要在细胞质中进行，而MEP途径主要在质体中进行，这两种途径都是将植物呼吸作用、光合作用等初生代谢反应所产生的中间产物（如丙酮酸、乙酰辅酶A等）经过一系列连续反应形成萜类物质合成的前体物质异戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸DMAPP的过程，不同配比（1∶1,2∶1,3∶1）的异戊二烯焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸DMAPP在烯丙基转移酶（牻牛儿基焦磷酸合酶GPS 、法呢基焦磷酸合酶FPS 、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶GGPS）作用下，合成香叶基焦磷酸GPP（牻牛儿基焦磷酸）、法尼基焦磷酸FPP、焦磷酸双香叶酯GGPP（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸），这些是低萜和高萜化合物的合成底物[4,5,6,7,13]。在非茶植物中萜类物质合成的研究证明异戊二烯焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸DMAPP的合成途径（MVA途径、MEP途径）已清楚（图2），而以GPP、FPP、GGPP为底物合成萜类化合物的反应则有待进一步的研究。

图2 萜类香气物质合成两条重要途径（MVA途径、MEP途径）

2.3 低萜和高萜合成酶与关键基因

随着茶叶加工过程中关于基因表达转录组学研究的不断深入，萜类挥发性香气合成酶以及相关基因已逐步被发现，通过生物信息学分析、原核生物以及模本植物转化表达验证、亚细胞定位等研究的基因已被克隆登记[1]。王让剑等[4]报道，在拟南芥、葡萄、烟草等40多种植物中克隆了200多个单萜和倍半萜合成酶基因，张冬桃等[1]研究发现，茶树萜烯类合成酶中单萜合成酶主要有：月桂烯合成酶、芳樟醇合成酶LIS、反式β-罗勒烯合成酶β-OCS、香叶烯合成酶MYS 、柠檬烯合成酶LIM 、水芹烯合成酶PHS、香叶醇/香茅醇乙酰基转移酶等；倍半萜合成酶主要有：大根香叶烯合成酶GES、法尼烯合成酶FAS；单萜/倍半萜合成酶主要有：橙花叔醇/芳樟醇合酶NES/LIS-1；倍半萜/二萜双合成酶主要有∶橙花叔醇/香叶基芳樟醇合成酶NES/GLS。陈寿松等[6]研究发现a-萜品醇合成酶基因CsTES、橙花叔醇/香叶基芳樟醇合成酶基因CsNES/GLS以及a-法尼烯合成酶基因CsFAS。闫振[2,4]等研究指出细胞质萜类合成酶由于底物法尼烯焦磷酸FPP的有效性（存在于细胞质）主要参与倍半萜的生物合成，质体萜类合成酶由于底物香叶基焦磷酸GPP的有效性（存在于质体中）则主要参与单萜的生物合成。茶树芳樟醇合成酶基因CsLIS/NES存在CsLIS/NES-1和CsLIS/NES-2两个亚型基因，CsLIS/NES-1定位于叶绿体而主要催化GPP合成芳樟醇；CsLIS/NES-2定位于细胞质而主要催化FPP合成橙花叔醇。Zhou等[13,14]报道乌龙茶加工过程中摇青阶段的连续伤害胁迫激活了CsNES的表达增加，导致E-橙花醇类化合物的积累，低温胁迫和机械损伤的联合胁迫具有协同效应，增强CsNES的表达和E-橙花醇的积累。Liu等[15]从茶尺蠖侵染的茶树转录组中找到两个新的倍半萜合酶基因CsAFR和CsNSE2可被植物诱导，并与萜类香气物质（E, E）-α-法尼烯和E-橙花醇合成有关。张冬桃等[16]研究表明萜类香气合成途径下游基因中，NDR是萜类代谢途径分支中的一种单萜合酶，由依赖黄素的短链脱氢酶/还原酶，催化薄荷酮还原成单萜环状具有芳香、清凉味的薄荷醇；Chen等[17]分离出一个罗勒烯合成酶基因CsOCS，通过大肠杆菌中的异源过表达、体外酶分析以及体内亚细胞定位分析表明，这是一种质体定位的TPS，以GPP为底物催化（E）-β-罗勒烯作为主要产物和（Z）-β-罗勒烯作为次要产物的产生，证实CsOCS是乌龙茶加工过程中β-罗勒烯合成的关键酶。在MVA途径和MEP途径中，途径反应清楚，限速酶和关键酶都清楚，在以后的众多研究主要集中于对茶叶香气贡献较大的橙花叔醇、芳樟醇、a-法尼烯、β-罗勒烯等萜类挥发性香气物质上，与橙花叔醇、芳樟醇合成相关的CsLIS/NES合成酶基因已被克隆，薄荷醇、香叶醇、a-法尼烯、β-罗勒烯、a-萜品醇等合成有关基因已被发现，但还未得到验证。另外熟悉萜类挥发性香气形成机制后，如何实验处理、外界诱因促进基因表达从而生成香气还需要进一步开展，这些研究对于指导乌龙茶加工技术、对于乌龙茶香气品质改良应用意义深远。

3 做青工艺中萜类挥发性香气形成机制研究概况

3.1 做青工艺中萜类香气变化趋势

乌龙茶的加工工艺相比其他茶类较为特殊，加工时长长，且集中在萎凋、做青和烘干工艺中；茶叶细胞完整度和细胞活性在乌龙茶加工过程中保持的最长久，使酶促反应在茶鲜叶中得以充分地进行[2]。在做青工艺的研究中发现，萜类香气物质在乌龙茶摇青阶段大量形成并释放，这些香气成分一同贡献于乌龙茶的特征香气，而在做青工艺中萜类香气是如何变化，对于乌龙茶香型的贡献构造如何，是茶叶香气研究中的热门话题。

宋加艳等[18]通过对茶树品种“碧香早”进行乌龙茶加工工艺制茶研究，发现在加工过程中增加的萜类香气组分有反式-橙花叔醇、二氢芳樟醇、β-紫罗酮、a-法尼烯等，这些香气组分有利于增加乌龙茶花果香；而橙花醇、芳樟醇、E-氧化芳樟醇等花果香成分则是逐渐减少，但仍对乌龙茶香气具有重要贡献。随着加工的进行，具有青草气味低沸点的罗勒烯等在摇青过程中逐渐降低。辛董董等[19]指出，在轻做青条件下，芳樟醇以及氧化物含量较高，香叶醇含量次之。苏中平等[20]研究指出乌龙茶加工中的最关键工序做青是通过摇青与摊放（静置）交替操作实现的，通过摇青能够显著增加乌龙茶中的橙花叔醇含量，并且乌龙茶中橙花叔醇、芳樟醇氧化物等的含量随着摇青次数的增加而增加；乌龙茶加工过程中的摇青是乌龙茶香气加速形成的保障，提高摇青的强度对提早出现乌龙茶特征品质有利。Ma等[21]采用HS-SPME/GC-MS结合化学计量学方法分析了乌龙茶生产过程中不同生产阶段挥发性成分的变化，结果表明，摇青阶段后乌龙茶中a-法尼烯、橙花醇等萜类香气成分含量显著增加。Chen等[22]采用UPLC-QTOF MS和GC-TOF MS对乌龙茶整个加工过程中的非挥发性成分和挥发性成分进行了代谢组学分析，研究得出，乌龙茶的特征挥发物如（E）-橙花醇在做青后期含量显著增加，并且做青工艺诱导（E）-橙花醇和a-法尼烯的产生，延长做青次数可以观察到这两种挥发物有更显著的增加趋势。此外，一些萜类挥发物，如（E）-β-罗勒烯和3，7-二甲基-1，5，7-辛三烯-3-醇，在做青工艺过程中也显著增加。而一些挥发物，如芳樟醇、顺式芳樟醇氧化物（呋喃酸）和（Z）-3-己烯-1-醇在该过程中没有显示出显著变化。刘洋等[23]研究指出在做青过程中，低沸点的青草气成分得以挥发和转化，高沸点的花果香成分显露出来，同时，伴随着内含物质的一系列变化，新的芳香物质大量形成，其中芳樟醇、法尼烯、橙花叔醇、植物醇等乌龙茶特征香气增加明显。

3.2 做青工艺中萜类香气基因表达情况研究概况

乌龙茶的做青可以看作是综合胁迫响应，即晾青过程的失水反应和摇青的持续性机械损伤[2]，且做青工艺对茶叶造成的持续性机械损伤和失水反应是诱导基因表达并释放香气的关键因素。其实乌龙茶的香气形成与加工工艺（萎凋、做青、烘干）关系最大，而烘干加工过程中，细胞活性丧失，香气变化主要为热化学反应；萎凋过程其实在白茶、红绿茶中也有所研究，而在做青过程中，该工艺的研究在生化成分与香气物质检测层面已经涉及不少，而关于差异基因表达方面的研究不多，于是萜类香气物质在乌龙茶做青阶段形成释放相关基因表达的研究值得深入。

Zeng和Zhou等[13,14,24]报道，做青工艺中茶叶叶片的连续损伤显著提高了CsNES的转录水平和（E）-橙花醇的含量。张冬桃等[16]报道随着做青过程的推进，CsIDI的表达量呈上升趋势，从二摇到三摇，表达量急剧上升，SAMT和SHT的表达量上升，而NDR的表达量却在二摇后降到最低，之后再缓慢上升，但整体呈下调趋势，其中IDI是萜类代谢途径分支（MEP代谢途径）中的一个关键节点酶，催化异戊二烯基焦磷酸与二甲基烯丙基焦磷酸相互转化，最后生成单萜、二萜和类胡萝卜素等茶叶香气相关物质；NDR是萜类代谢途径分支中的一种单萜合酶，由依赖黄素的短链脱氢酶/还原酶，催化薄荷酮还原成单萜环状具有芳香、清凉味的薄荷醇；SAMT是萜类代谢途径中的修饰酶；SHT是萜类化合物代谢途径中的一类修饰酶，参与萜类代谢途径的下游阶段。Hu等[25]通过转录组分析显示，MVA通路中只有少数基因在第一次摇青和晾青后表达上调，而MEP通路中几乎所有基因在第一次摇青和晾青后表达上调，在该途径的下游，负责最终萜类化合物产生的几种TPS基因的表达也被上调。Chen等[17]研究指出在乌龙茶加工过程中，多种胁迫导致JAs水平升高，增强了CsOCS的表达，导致β-罗勒烯的香气积累达到较高水平。吴晴阳等[26]研究指出随着乌龙茶加工的进展，CsAFS7基因的表达水平呈现逐渐上升的趋势，在鲜叶阶段CsAFS7的表达水平最低，在第三次摇青后测得最高值。由此可见，AFS基因的表达对α-法尼烯合成与代谢有关键作用，这些研究展开可以通过设置不同摇青程度处理进行转录组分析测得，但是这些实验的展开与结果的综合有助于明确乌龙茶做青工艺中萜类香气物质形成机制。

4 研究展望

综上所述，首先，香气形成机制的研究给乌龙茶做青工艺一个科学合理的解释，根据诸多研究大致总结乌龙茶做青工艺中萜类香气物质形成机制，做青工艺中的摇青，即由摇青器械对茶叶造成的机械损伤，导致叶片失水速率加大以及内源乙烯的多次跃变，且在摇青和晾青的共同作用下，叶片呼吸强度急剧上升，香气和酶的活性也发生变化。与其他茶类相比，乌龙茶的加工工艺相对复杂并使其具有特殊的香型，同时，复杂的加工过程使茶叶受到多种胁迫影响，从而促进基因表达，有关萜类香气物质的酶合成，以单一或者多种底物为基础，在单一或者多种酶作用下，新的萜类香气物质合成。与此同时，低沸点挥发性强的萜类香气物质有所下降，例如罗勒烯等，高沸点的萜类香气物质逐渐显现[27,28]。乌龙茶生产过程的综合胁迫响应成为研究采后加工过程茶叶香气形成的良好模型。尽管众多研究综合起来显示在做青工艺中萜类香气物质变化确实有如此趋势，但是仍然有许多问题有待进一步解决。

其次，可以从萜烯类挥发性香气变化和比例来判别摇青程度的合适与否，并且根据不同胁迫处理促进萜类香气物质释放来测量香气物质含量再结合感官审评和理化成分含量综合分析给乌龙茶制茶工艺一种新型的思路。

再次，部分萜烯类香气研究应更加深入，那些已经被发现与萜类香气物质相关基因还需进一步验证，例如构建进化树，寻找茶树该基因与模式植物基因序列的差异；蛋白原核表达和纯化，通过做体外催化实验，验证某个基因编码的酶参与了特定物质的合成，对于验证合成酶基因的功能是比较好的方法；在模式植物中检验目的基因表型，可通过将目的基因导入农杆菌再植入模式植物拟南芥中来验证表型，也可做本氏烟草的瞬时超表达实验。目前关于茶树的整个基因组情况尚不明确以及茶树再生体系构建困难等瓶颈，是导致深入开展茶树分子水平研究进展缓慢的主要原因[6]。关于各种萜类合成关键基因的功能鉴定（瞬时表达、基因敲除）等方面研究仍需要借鉴其他模式植物在挥发性萜类物质形成及其代谢途径方面的研究思路和成果。越来越多研究表明，植物中的各代谢途径并不是孤立存在的，而是存在交互作用[29]。虽然茶叶中的类胡萝卜素合成及代谢相关基因（CsLCYB、CsLCYE、CsCCDI和CsCCD4）已在原核生物菌中进行了功能验证，但这些基因的体内功能和类胡萝卜素氧化降解途径与萜类物质合成途径之间的衔接关系仍需进一步明确，这些信息将为茶树种质资源创制和茶叶加工品质调控提供必要的理论基础。由于萜类香气物质合成途径还有许多地方需要完善，部分萜烯类香气的研究仍然是一个值得深入的方面。

本项目得到广东省农业科研项目和农业技术推广项目（2021年）“客家炒绿茶提质增效综合技术研究与推广”的资助。