环状RNA在乳腺癌中作用的研究进展

何 啸，胡为杰，吕文昌，任玉萍，吴 敏，吴毅平，张 奇

(华中科技大学同济医学院附属同济医院 整形美容外科，湖北 武汉 430022)

乳腺癌(breast cancer，BC)是中国女性发病率最高的癌，并且是导致癌死亡的主要原因[1]。乳腺癌有5种基因分型，主要包括管腔上皮A型、管腔上皮B型、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)过表达型、基底样型和正常乳腺样型。此外，三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)具有高转移、复发等恶性特征，其免疫组织化学定义是雌激素受体、孕激素受体和HER2的表达缺失，且其中50%～75%的TNBC为基底样型[2]。乳腺癌具有高复发性、高转移性及耐药性等特征，仍是当前亟待解决的难题。基于新型肿瘤分子靶点的发现与机制研究，对乳腺癌治疗具有重要的意义。内源性环状RNA(circular RNA，circRNA)为一类新型的非编码RNA，在果蝇、小鼠、人类等多种物种中均有表达。最新研究表明，circRNA参与了乳腺癌发生、发展和转移并干预乳腺癌治疗效果。因此，本文主要综述了近年来circRNA在乳腺癌中的作用机制和耐药的研究进展。译circRNA在乳腺癌中的功能与机制，将有助于实现对乳腺癌肿瘤本质的新认识，提供新颖的乳腺癌治疗策略。

1 CircRNA分类和形成

CircRNA根据其组成可分为3种类型：外显子circRNA(exonic circRNA，ecircRNA)、内含子circRNA(circular intronic RNA，ciRNA)和外显子-内含子circRNA(exon-intronic circRNA，EIciRNA)[3]。CircRNA的形成是一种可变的环化剪接，根据剪接位点的不同，产生不同类型的circRNA，主要包括三种机制：外显子跳跃、直接反向剪接和依赖RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)剪接。外显子跳跃指的是pre-mRNA在转录过程中被部分折叠，导致下游外显子的3-SD(splicing donor)与上游外显子的5′-SA(splicing acceptor)连接，形成既包含外显子又包含内含子的RNA套索，移除内含子后，最终形成ecircRNA。直接反向剪接则是pre-mRNA的侧翼内含子互补序列通过直接碱基配对形成套索，通过去除或保留内含子可分别形成ecircRNA或EIciRNA。依赖RBP剪接是指，RBP与外显子两侧的内含子上、下游碱基序列结合，拉进两侧内含子之间的距离，形成circRNA。

2 CircRNA主要特征

CircRNA具有多样性、特异性、保守性和稳定性等特征。就多样性而言，circRNA广泛表达于多种原生生物、真菌、果蝇、植物和人类等生命体。CircRNA也存在于人体多种体液、组织和器官中。在一些特殊情况下，单个细胞中circRNA比相关的信使RNA(messenger RNA，mRNA)更为丰富。CircRNA具有特异性，即不同细胞、组织中，或者同一组织正常和病理状态中，存在差异性的circRNA表达谱，并且会随着细胞周期进程发生变化。例如，circRNA在幼猪脑发育过程中呈时空动态性变化[4]。CircRNA表达谱在各物种之间具有保守性，不仅在哺乳动物中是保守的，且在进化上相对较远的果蝇间也具有保守性。CircRNA是RNA剪接的保守且非随机产物，与ALU重复有关，并参与调控基因表达[5]。有意思的是，在猪中的大约20%与circRNA生成相关的剪切位点在老鼠和人类中也有相同的功能[6]。此外，circRNA通过5′与3′端首尾相连共价闭合形成环状分子，在结构上缺乏易被降解的3′端poly尾。因此，circRNA在一定程度上可避免被RNA外切酶降解，并通过RNA折叠维持基因结构，使得circRNA具有较高的稳定性。

3 CircRNA调控机制

CircRNA主要通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)、结合RBP、调节转录和翻译以及生成假基因来发挥调控作用。CeRNA功能是circRNA最经典的肿瘤学作用机制，即circRNA可通过碱基互补配对竞争性结合微小RNA(microRNA，miRNA)，对miRNA产生“海绵作用”，抑制miRNA的负性调节作用，从而提高相应mRNA的胞内浓度并调节细胞功能(图1)。RBP是一类可以结合RNA并协助调控基因转录和翻译的蛋白质，在circRNA的剪接、处理、折叠、稳定和定位中发挥重要作用。CircRNA与RBP的结合同样参与了调控肿瘤进展。EIciRNA主要定位在细胞核中，可与U1核小RNA结合形成复合体，再与转录复合物启动子Pol Ⅱ相互作用，最终促进亲本基因表达[7]。一些位于细胞质的内源性circRNA具有合适的结构和翻译长度，这表明circRNA具有一定的蛋白质编码潜力[8]。然而关于乳腺癌中circRNA翻译功能的研究还尚未见诸报道。CircRNA可通过反转录形成假基因，而假基因可调控DNA、RNA和蛋白质水平并广泛存在于多种肿瘤中。目前关于circRNA和假基因的研究非常少，有待进一步探索。

图1 CircRNA最主要的肿瘤学作用机制

4 CircRNA在乳腺癌(BC)中作用的相关机制

4.1 CircRNA调控乳腺癌(BC)细胞增殖

在TNBC中，circRNA可以通过多种方式调节癌细胞增殖。Circ-TFCP2L1在TNBC中显著上调，导致TNBC患者的无病生存时间缩短。Circ-TFCP2L1通过海绵化miR-7来降低PAK1的表达，从而诱导TNBC的增殖和迁移[9]。CircPLK1通过竞争性结合miR-296-5p，增加Plk1合成，最终可促进细胞增殖[10]；CircAGFG1作为miR-195-5p的“海绵”，可缓解miR-195-5p对CCNE1的抑制作用，从而加速细胞分裂和增殖[11]。CircRNA_069718在TNBC组织和细胞中表达明显增加，降低circRNA_069718的表达可抑制Wnt/β-catenin信号通路来减少β-catenin、原癌基因、cyclin D1的表达，进而抑制TNBC的增殖[12]。与之相反，circ-ITCH的显著下调与TNBC的不良预后有关，circ-ITCH可以结合miR-214和miR-17并增加ITCH的表达，从而灭活Wnt/β-catenin信号，抑制TNBC的增殖[13]。

低氧是乳腺肿瘤微环境的主要特征之一。低氧可通过circRNA-miRNA-mRNA轴调控乳腺癌细胞分化、增殖及转移。CircDENND4C可竞争性结合miR-200b和miR-200c，而下调circDENND4C的表达可通过促进miR-200b和miR-200c的表达进而抑制乳腺癌细胞的糖酵解、转移和侵袭能力[14]。低氧微环境会诱导乳腺癌细胞中HIF1α相关的circDENND4C表达，而敲除circDENND4C基因，可以抑制低氧环境下乳腺癌细胞的增殖和转移[15]。

4.2 CircRNA调控乳腺癌(BC)细胞转移

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是乳腺癌细胞获得侵袭能力的重要途径，指上皮细胞失去细胞极性以及与基底膜间的连接，进而获得高转移、抗凋亡和可降解细胞外基质等特性。CircANKS1B通过竞争性结合miR-148a-3p和miR-152-3p来增加转录因子USF1的表达，进而激活TGF-β1/Smad信号、促进EMT，最终促进了TNBC的侵袭转移[16]。Hsa_circ_001569基因表达下调可减少PI3K/AKT通路激活和抑制EMT效应，并因此抑制乳腺癌细胞的增殖和转移[17]。Circ-TFF1和TFF1在BC中均过表达且呈正相关。Circ-TFF1在体外可促进BC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，在体内可通过海绵化miR-326增加TFF1表达，促进BC细胞增殖[18]。CircRNA-miRNA-mRNA轴可能在乳腺癌转移癌的治疗中发挥重要作用。Hsa_circ_21439和hsa_circ_11783分别是肝转移癌组织细胞中表达上调和下调最显著的circRNA，且这两种circRNA可以作为ceRNA发挥作用，可能是乳腺癌肝转移潜在的治疗靶点[19]。

4.3 CircRNA调控乳腺癌(BC)化疗耐药

乳腺癌耐药特征是影响乳腺癌治疗的重要因素之一。阿霉素、他莫西芬、单星素已被广泛应用于乳腺癌患者的化学药物治疗(简称化疗)，circRNA主要参与了这3种化疗药物的耐药作用。

阿霉素是一种抑制DNA和RNA合成的临床用广谱抗肿瘤药物。CircKDM4C可竞争性结合miR-548p，而上调miR-548p的表达可逆转circKDM4C诱导的乳腺癌细胞恶性表型减弱和PBLD的表达升高[20]。CircKDM4C在体内外均可显著抑制乳腺癌的增殖和转移，并减缓乳腺癌患者对阿霉素的耐药。与阿霉素敏感组相比，hsa_circ_0006528在阿霉素耐药细胞系和组织中表达水平更高。相关机制可能为hsa_circ_0006528竞争性结合miR-7-5p，从而抑制Raf1相关MAPK信号通路，促进乳腺癌阿霉素耐药的发生[21]。

他莫昔芬是一种主要用于雌激素受体阳性乳腺癌患者的非甾体类药物。CircBMPR2在人乳腺癌组织中表达显著下调，同时circBMPR2的下调可抑制他莫昔芬诱导的细胞凋亡，促进乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药[22]。Hsa_circ_0025202在乳腺癌组织中表达明显降低，其可通过竞争性结合miR-182-5p来调控FOXO3a的表达和活性，抑制肿瘤细胞增殖和转移，增加乳腺癌细胞凋亡和对他莫昔芬的敏感性[23]。此外，上调circRNA CDR1-AS的表达，可通过抑制hsa-miR-7功能，减少了他莫昔芬治疗乳腺癌的不良反应，增强乳腺癌复发患者疗效[24]。

单星素是一类作用于有丝分裂纺锤体的乳腺癌化疗药物，能通过抑制有丝分裂驱动蛋白Eg5活性发挥肿瘤抑制作用。CircRNA-MTO1在单星素耐药细胞中表达水平升高，此外circRNA-MTO1可通过结合TRAF4，并抑制TRAF4所激活的Eg5翻译从而抑制Eg5蛋白水平，证实circRNA-MTO1的调控机制可影响乳腺癌细胞生存力和单星素耐药性[25]。

5 问题与展望

作为新兴的调控分子，circRNA参与了乳腺癌的增殖、侵袭、转移和化疗耐药。CircRNA主要通过ceRNA机制调控乳腺癌相关基因的表达，从而发挥致癌或抑癌作用。然而，关于circRNA的研究还处于方兴未艾阶段，仍有许多问题有待探索，如circRNA命名缺乏统一标准，以及circRNA乳腺癌中的功能和机制的研究还比较少；而且，阐明乳腺癌中circRNA的生物发生、降解、细胞定位和作用机制仍然至关重要；此外，circRNA对乳腺癌治疗主要聚焦于化疗药物耐药特性，而circRNA对其他免疫治疗、放射治疗等抵抗作用还知之甚少，也需要格外的关注。深入了解circRNA在乳腺癌中的作用机制和耐药影响，将促进乳腺癌治疗策略的开发，以及有益于乳腺癌相关的早期筛查、精准诊断和预后监测等诸多领域。