尿素包合法富集八月瓜籽中不饱和脂肪酸工艺研究*

陈荣昌，张 迪，陈 青，王 妍，杨海鹏，李 挺

(贵州大学化学与化工学院，贵州 贵阳 550025)

八月瓜(HolboellialatifoliaWall)为木通科八月瓜属(Holboellia)双子叶被子植物，主要分布于云南、四川雅安、贵州铜仁等地区。八月瓜生长在山麓谷地、林缘灌木丛中，农历八月瓜熟开口。野生八月瓜在贵州分布广、种类多[1]。研究表明，八月瓜叶、果皮和果肉中含有总酚、总黄酮、抗坏血酸及 9 种酚类，八月瓜叶的抗氧化活性指数最高儿茶素、阿魏酸、总酚和总黄酮TRPA 值贡献极强，儿茶素、香豆酸、阿魏酸、抗坏血酸和总酚对ABTS+自由基清除能力贡献极强，阿魏酸、总酚和总黄酮对FRAP 值贡献极强，儿茶素、p-香豆酸、阿魏酸、抗坏血酸和总酚对ABTS+自由基清除能力贡献极强。八月瓜具有较高的清除自由基和抑制 α-葡萄糖苷酶活性的能力，其中果皮和种籽提取物具有对DPPH自由基清除能力，说明八月瓜是一种具有较高开发价值的药食同源资源[2-3]。八月瓜籽中不饱和脂肪烃主要是油酸及亚油酸两种。其中亚油酸能降低血液胆固醇，预防动脉粥样硬化而倍受重视。而油酸除了供给人体所需的大量热能外，还能调整人体血浆中高、低密度脂蛋白胆固醇的浓度比例[4-6]。尿素包合法是一种多不饱和脂肪酸的常用富集方法，具有所需设备简单、操作方便，原料无毒害且可回收再利用的优点，是符合一种绿色化学的[7]。目前，以八月瓜油为原料富集不饱和脂肪酸未见报道，鉴于此，本文以贵州产八月瓜籽为原料，采用尿素包合法富集八月瓜籽油不饱和脂肪酸，以表示脂肪酸不饱和程度的指标碘值为标准，通过响应面法对富集工艺进行优化。研究可为八月瓜的综合利用提供新的思路。

1 实 验

1.1 材料与仪器

八月瓜，购于贵阳市场；95%乙醇、石油醚、尿素、正己烷、环己烷、冰乙酸、浓盐酸、碘化钾、一氯化碘、氢氧化钾、氯化钠、无水硫酸钠、淀粉等均为分析纯，重庆川东化工有限公司；14%三氟化硼-甲醇溶液、硫代硫酸钠标准溶液、蒸馏水，碘化钾溶液均为实验室自制。

电数显水浴锅，国华(常州)仪器制造有限公司；循环水式真空泵，郑州生化仪器有限公司；分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣；HGC-12A数显恒温水浴锅氮吹仪，天津恒奥；Agilent 7890-5975气相色谱质谱联用仪，Agilent 7890气相色谱仪配FID检测器，美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 八月瓜籽油的提取

鲜果购回后，经果肉分离，果籽自然干燥和真空干燥，用植物粉碎机粉碎至30目。然后将果籽粉用滤纸包裹后放入索式提取器中，将石油醚作为溶剂提取，把果籽粉和石油醚的比例设定为1:6(g:mL)，反应时间保持为6 h。反应结束后，将用旋转蒸发仪蒸干提取后的溶液，以便除去溶液里含有的石油醚，这样便可以得八月瓜籽油，瓜籽油呈淡黄色，得油率为8.3%。

1.2.2 尿素包合法富集八月瓜籽油不饱和脂肪酸[8]

称取10 g八月瓜籽油缓慢滴入40 mL浓度为5%氢氧化钾乙醇溶液中，置于磁力搅拌器77 ℃水浴搅拌皂化82 min，静置至室温后加入蒸馏水至溶液澄清。用浓盐酸调溶液pH至2.5，加入正己烷于分液漏斗中萃取两次，静置，弃水层。蒸馏水水洗有机层至中性，用无水硫酸钠干燥脱水后，过滤，减压回收溶剂，得到混合脂肪酸。

称取5 g尿素、2 g八月瓜油混合脂肪酸，加入20 mL 95%乙醇溶液于100 mL烧瓶，置77 ℃的恒温水浴中磁力搅拌并回流40 min至混合溶液呈透明的淡黄色后，冷却至室温，冰箱中沉淀；沉淀抽滤后，滤液减压回收溶剂，加入去离子水洗涤残留尿素，加入无水硫酸钠干燥过夜，过滤得到富集的八月瓜籽油不饱和脂肪酸。

1.2.3 碘值的测定

碘值的测定参照 GB/T 5532—2008标准测定。

1.2.4 脂肪酸组成测定

以未富集的八月瓜籽油及富集后的八月瓜籽油为样品，甲酯化后，采用GC-MS联用法进行组成测定。

甲酯化方法：称取100 mg不饱和脂肪酸加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，60 ℃水浴30 min进行甲酯化，冷却至室温，加1 mL蒸溜水和2 mL正己烷振荡，静置分层后吸取上层有机层，氮气吹挥干溶剂后用1 mL正己烷溶解，样品进行GC-MS分析。

气相色谱条件：色谱柱：HF-5MS,60 m×250 μm× 0.25 μm；进样口温度：280 ℃；载气：He；流速：恒流 1.5 mL/min；传输线温度：260 ℃；升温程序：初始110 ℃，5 ℃/min升到140 ℃，维持5 min；5 ℃/min升到180 ℃，维持5 min； 5 ℃/min升到250 ℃，维持5 min； 5 ℃/min升到 280 ℃，维持5 min。

质谱条件：GC/MS接口温度280 ℃，EI离子源，电离能量70 eV,离子源温度230 ℃，扫描周期2.48 次/s，质量扫描范围m/z50-500 u。

1.3 单因素实验设计

每次实验称取八月瓜籽油脂肪酸2 g，分别以尿醇比(脂肪酸：尿素：乙醇(95%))(1:2.5:7、1:2.5:9、1:2.5:11、1:2.5:13、1:2.5:15)，包合时间(1 h、6 h、12 h、18 h、24 h)，包合温度(-24 ℃、-16 ℃、-8 ℃、0 ℃、8 ℃、16 ℃)进行单因素实验，以碘值为指标，选出最优实验条件。

1.4 响应面优化实验设计[9-10]

响应面法是通过回归方程拟合单因素实验得到的数据，应用Design-Expert 8.0.6数据分析软件，根据 Box-Behnken实验设计原理，在单因素实验基础上，选择尿醇比，包合时间，包合温度三个因素为自变量，碘值为响应值，用响应面法设计三因素三水平的中心组合实验，以优化八月瓜籽油尿素包合法富集工艺，实验因素水平表见表1。

表1 实验因素水平表Table 1 Experimental factor level table

2 结果与讨论

2.1 尿素富集单因素实验结果与分析

2.1.1 尿素与乙醇质量体积比对包合反应的影响

八月瓜籽油分别在尿素与乙醇质量体积比为2.5:7、2.5:9、2.5:11、2.5:13、2.5:15、2.5:17 的实验条件下进行非均相反应，反应时间18 h，反应温度0 ℃，对不饱和脂肪酸进行碘值测定，结果如图1所示。

图1 尿醇比对包合反应的影响Fig.1 Influence of urea to ethanol ratio on inclusion reaction

随着尿醇比的变化碘值呈现出先增大后减小的变化趋势，且2.5:7～2.5:13的实验条件下碘值上升迅速，而2.5: 13～2.5:17下降趋势缓慢。原因可能是由于溶剂用量增大，八月瓜籽油脂肪酸将更多地溶解在95%乙醇中，减少了过滤过程中晶粒对其的包藏；同时溶剂作为提供结晶过程质量传递的场所，溶剂用量越大，尿包对脂肪酸的包合度将会增大，故在尿醇比为2.5:13后碘值会下降[9]。因此选用2.5:13为最佳尿醇比条件。

2.1.2 包合时间对包合反应的影响

八月瓜籽油在尿素与乙醇质量体积比2.5:13，包合温度 0 ℃的条件下进行包合，包合时间分别为1、6、12、18、24、30 h，对不饱和脂肪酸进行碘值测定，结果见图2。

图2 包合时间对包合反应的影响Fig.2 Influence of inclusion time on inclusion reaction

随着包合时间的延长，碘值缓慢上升，当反应到12 h后，碘值迅速上升，包合时间为18 h 时，碘值达到最高值，随后再延长反应时间碘值下降。因此选用18 h为最佳包合反应时间。

2.1.3 包合温度对包合反应的影响

八月瓜籽油在尿素与乙醇质量体积比2.5:13，包合时间 18 h 的条件下进行包合，包合温度分别为 -24、-16、-8、 0、8、16、24 ℃，对不饱和脂肪酸 进行碘值测定，结果见3。

图3 包合温度对包合反应的影响Fig.3 Influence of inclusion temperature on inclusion reaction

尿素包合为放热反应，故随着温度的降低，碘值逐渐增大，在-24～0 ℃碘值趋近于平缓，随后下降，-24 ℃包合效果最好，碘值达到123.76 g/100 g。因此选用-24 ℃为最佳包合反应温度。

2.2 尿素富集响应面优化实验结果与分析

2.2.1 工艺模型建立及检验

采用 Box-Behnken 原理设计三因素三水平实验对八月瓜籽油富集不饱和脂肪酸工以艺进行优化，A为尿醇比、B为包合时间、C为包合温度，响应值(Y)为碘值，确定最富集工艺条件，响应面试验因素水平见表2，响应面试验设计及结果见表3，回归模型方差分析见表4。

表2 响应面试验因素水平Table 2 Response surface test factor levels

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface test design and results

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

通过 Design Expert 8.0.6 回归拟合表3实验数据，得到的拟合函数模型为： Y=+123.51+9.42 * A+5.43* B-10.72 * C-0.64* A * B+10.37* A * C-23.40* B * C+7.60* A2-6.91* B2+21.96* C2。

由表3、表4可知，该模型影响极显著(P<0.0001)，且其失拟项不显著(P=0.0935>0.05)，回归系数 R2为0.9993，表明回归模型的拟合效果越好，其校正决定系数 R2Adj为0.9981，表明该模型能解释99.81%响应值的变化,模型预测值与实测值能较好地吻合。包合温度、尿素乙醇添加量、包合反应时间的Prob>F值都<0.0001，说明A、B、C对Y值的影响达到了高度显著的水平。尿素包合法富集八月瓜籽中不饱和脂肪酸实验条件中，C对Y的影响最大，B对Y的影响最小。在富集不饱和脂肪酸实验研究的参数中，各因素对碘值的影响从大到小依次为： 包合温度>尿素乙醇添加量>包合反应时间。根据响应面优化结果和综合因素影响得到尿素包合法富集八月瓜籽中不饱和脂肪酸的最佳工艺条件为尿醇比2.5:11、包合温度-24 ℃、包合时间24 h，在此条件下碘值的预测值为187.03 g/100 mg。在最佳条件下进行平行三次实验验证，碘值平均值为189.85 g/100 mg，与预测值误差率为1.51%，证明模型可靠，具有实际意义。

2.2.2 响应面分析与优化

如图4～图6所示，通过 Box-Behnken 实验得到了各影响因素之间对碘值影响的响应面图及其等高线图，能够较为直观地反映包合温度、尿素乙醇添加量 、 包合反应时间的相互作用对八月瓜籽中不饱和脂肪酸富集程度。在响应面图中，圆形等高线表示参数之间交互怍用不显著,而椭圆型图 或马鞍型图 等高线则表示参数之间交互性能较强，故包合温度与尿醇比、包合温度与包合时间交互作用强[12-13]。

图4 尿醇比和包合时间对碘值影响的响应面和等高线Fig.4 Response surface and contour of the effect of urea ethanol ratio and inclusion time on iodine value

图5 尿醇比和包合温度对碘值的影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface and contour of the effect of urea ethanol ratio and inclusion temperature on iodine value

图6 包合温度和包合时间对碘值的影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface and contour of the effect of inclusion temperature and inclusion time on iodine value

由图4可知，当温度不变时，随尿醇比的增加，碘值呈减小趋势，包合时间逐渐减小时，碘值减小的趋势变得平缓，且整体的碘值偏大。如尿醇比0.17 g/mL时间12.24 h时碘值163.12 g/100 mg；尿醇比0.17 g/mL时间23.53 h时碘值129.46 g/100 mg；尿醇比0.23 g/mL时间23.53 h时碘值98.89 g/100 mg。故较适宜的包合时间在12～18 h，这与单因素的结论一致。

由图5可以看出，当特征值均为正值时，响应面分析图为山谷形曲面，存在极小值。随着温度与尿醇比的增加，脱酸率先减小后增大，说明增加包合温度并增大尿醇比，不利于不饱和脂肪酸的富集，持续增加两个因素，会使得碘值略微增加。

由图6可得，当特征值有正有负时，响应面分析图为马鞍形曲面，无极值存在。包合温度较高时，包合时间适宜较长，而包合温度较低时，包合时间适宜较短，如温度-23.71 ℃时间23.63 h时碘值181.226 g/100 mg；但温度-23.71 ℃时间12.92 h时碘值132.97 g/100 mg；温度-8.34 ℃时间12.99 h时碘值164.05 g/100 mg；但温度-8.34 ℃时间23.63 h时碘值130.30 g/100 mg。

2.3 脂肪酸组成测定结果

按照GC-MS分析条件对八月瓜籽油富集前后脂肪酸化学成分进行检测分析，结果如图7、图8和表7所示。

图7 八月瓜籽油富集前脂肪酸总离子流图Fig.7 Total ion flow of fatty acids before Holboellia latifoliaWall seed oil enrichment

图8 八月瓜籽油富集后脂肪酸总离子流图Fig.8 Total ion flow of fatty acids after Holboellia latifoliaWall seed oil enrichment

表7 八月瓜籽油富集前后的脂肪酸化学成分Table 7 Chemical composition of fatty acids before and after enrichment of Holboellia latifolia Wall seed oil

由以上实验结果可知，八月瓜籽油富集前主要含有5种脂肪酸，分别为棕榈酸、亚油酸、油酸、反油酸及硬脂酸，其中不饱和脂肪酸总含量为72.78%，富集后的八月瓜籽油中主要含有亚油酸和油酸，不饱和脂肪酸总含量提高到95.81%，通过尿素包合法达到富集不饱和脂肪酸的目的。亚油酸是人体各器官正常工作的必须的脂肪酸，现代医学研究发现，胆固醇必须与亚油酸结合才能在体内进行正常的运转和代谢；当人体缺乏亚油酸时，胆固醇与饱和脂肪酸结合将发生代谢上的障碍，并沉积在血管壁上，形成动脉粥样硬化，从而引发心脑血管疾病[11]。用尿素包合富集的方法可以大大提高提取不饱和脂肪酸的含量[12-13]，八月瓜籽油富集后亚油酸的含量提高到61.79%，可以作为亚油酸的植物来源使用。

3 结 论

采用索氏提取和尿素包合法对八月瓜籽中的脂肪酸进行提取，提取的籽油经过皂化反应和尿素包合反应可以得到高纯度的不饱和脂肪酸，纯化后八月瓜籽中不饱和脂肪酸含量从72.78%提高到95.81%，碘值也由44.52 g/100 mg 提升到189.85 g/100 mg，达到富集纯化的目的。响应面法优化后的富集工艺条件为：尿素与95 %乙醇质量体积比2.5:11、包合温度-24 ℃、包合时间24 h，在最佳条件下碘值平均值为189.85 g/100 mg，实验结果与预测值接近，各因素对碘值的影响次序为包合温度>尿素乙醇添加量>包合反应时间。研究可为八月瓜籽的综合利用提供新思路。