基于网络药理学与分子对接探讨五味子治疗急性肝损伤的作用机制

沈朝壮，王晓虎#，李 超，沈萍萍，谢海棠

(1.皖南医学院 研究生院，安徽 芜湖 241002；2.皖南医学院 医学信息学院，安徽 芜湖 241002；3.皖南医学院弋矶山医院 安徽省药物临床评价中心，安徽 芜湖 241001)

五味子始记于《神农本草经》，为木兰科植物五味子〔Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.〕成熟的干燥果实，含有木脂素类、多糖类、挥发油类、有机酸类等多种活性成分.现代药理学研究显示五味子及其化学成分具有多种生物活性，包括保肝[3]、止咳[4]、抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、镇静催眠[7]、抗癌[8]等作用.已有较多研究表明，五味子对多种肝脏疾病均具有较好的防治作用，且临床上已有多种含五味子的中成药或中药制剂如五酯胶囊、五味子颗粒等，广泛用于预防和治疗肝脏疾病.

中药具有“多组分，多靶点”的特点，传统方法很难对其进行系统的探讨.网络药理学概念由Andrew L Hopkins首次提出[9]，其强调从系统层次和网络大数据的整体角度出发，分析药物对疾病潜在的治疗机制，为中药复杂体系研究提供了新思路.我国在最新发布的首个《网络药理学评价方法指南》[10]中对网络药理学的具体评价要求作出详细的阐述.现已有使用网络药理学技术针对五味子中有效成分抗癌机制的研究[8]，本文利用网络药理学结合分子对接的方法探讨五味子治疗急性肝损伤的分子作用机制，为五味子进一步开发提供参考.

1 材料与方法

1.1 药物有效成分及靶点筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://tcmsp-e.com)检索五味子全部有效成分，并根据口服生物利用度(OB)≥30%初步筛选，再将初步筛选结果导入SwissADME(http://www.swissadme.ch)数据库预测类药性(DL)，并选取GI absorption为“High”且符合Lipinski’s五规则[11]的成分，最终结合文献确定纳入研究的有效成分，并在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中校准名称.

将筛选的有效成分导入PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)数据库，以Norm Fit≥0.9为阈值筛选潜在靶点，并与TCMSP数据库靶点合并，导入Uniprot(https://www.uniprot.org)数据库中匹配基因名.

1.2 ALI疾病靶点筛选

以“acute liver injury”为关键词，挖掘OMIM(https://omim.org)、Genecards(https://www.genecards.org)、NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search)数据库中ALI相关靶点.其中Genecards数据库靶点根据Score值进行排序，Score值越大代表靶点与疾病越相关，并以Score≥10为阈值筛选靶点.将3个数据库中所筛选得到的靶点汇总并删去重复值.

1.3 药物-靶点-疾病网络构建

将药物靶点与ALI靶点取交集，并将药物有效成分、交集靶点、疾病等信息进行汇总分类构建药物-靶点-疾病网络.将其导入Cytoscape 3.8.2软件进行分析，根据各节点度值对网络进行可视性优化.

1.4 PPI网络构建

将交集靶点导入STRING11.0(https://www.string-db.org)数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络.物种类别设置为“Homo sapiens”，阈值为“medium confidence(0.400)”，构建出PPI网络并隐藏网络中无连接的节点.将构建好的PPI网络导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视性优化，并使用MCODE插件找出网络中的核心靶点子网络，根据Score值进行排序，选取Score值最大的核心靶点子网络进行可视化，并将选取的子网络中所有基因在药物-靶点-疾病网络中找出相关联的所有有效成分进行分析.

表1 五味子主要有效成分Tab.1 The main active ingredients of Schisandra chinensis

图1 维恩图Fig.1 Venn map

1.5 KEGG、GO富集分析

为进一步探讨交集靶点可能涉及的信号通路、生物进程(Biological Process，BP)、细胞组分(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)等信息，将交集靶点导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov)数据库进行KEGG和GO富集分析.设置标识符为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”,物种为“Homo sapiens”进行分析并下载分析文件，将数据按Pvalue值进行排序，最终设定阈值为P<0.001，筛选相关信息.

2018年12月12日，北京—2018加拿大木材中国论坛暨现代木结构建筑在健康养生产业的应用活动在北京朝阳悠唐皇冠假日酒店举行，此次活动由加拿大木业主办。活动吸引了超过250名专业人士的热情参与。出席此次论坛的演讲嘉宾包括：中国木材及木制品流通协会首席专家朱光前先生，来自加拿大温哥华沿海健康家庭护理区域主管Jo-Ann G. Tait女士以及加拿大Equilibrium工程咨询公司联合创始人Robert Malczyk先生等。

1.6 药物-靶点-通路-疾病网络

将处理后的药物有效成分、靶点、信号通路、疾病数据文件导入Cytoscape 3.8.2软件进行分析，根据各节点度值、介度及紧密度等网络拓扑学参数筛选出起主要药效作用的成分.并将结果与药物-靶点-疾病网络、PPI网络结果进行对比，找出两网络筛选出的共同的有效成分及靶点.

1.7 分子对接验证

综合上述所构建网络筛选出成分和靶点进行分子对接，使用RCSB PDB(https://www.rcsb.org)数据库根据分辨率(Resolution)及相关性排名选取基因蛋白骨架下载其“pdb”文件，使用TCMSP数据库下载代表成分的分子结构“mol2”文件.用AutoDock Vina进行分子对接并计算每种构象的结合能，选取结合能最优的构象与靶点蛋白对接并保存对接后的复合物文件，将复合物文件导入Python-Pymol 2.5.0软件进行最终可视化.

2 结果

2.1 五味子有效成分及靶点筛选

通过TCMSP及SwissADME数据库并结合文献筛选，有17种有效成分纳入研究(表1).其中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素为文献报道对急性肝损伤有治疗作用的有效成分[12-13].通过PharmMapper数据库预测潜在靶点，根据阈值筛选，去除重复值后共得到103个靶点并导入Uniprot数据库匹配基因名及化学文摘服务社(Chemical Abstracts Service，CAS)号码.

2.2 五味子治疗ALI靶点筛选

挖掘OMIM、Genecards、NCBI数据库中ALI靶点，筛选汇总并删除重复值后得到1 870个靶点，将筛选出的药物靶点与疾病靶点取交集并作图(图1).结果得到交集靶点50个，其中包含CA2、GSTP1、PIM1等.

图2 药物-靶点-疾病网络Fig.2 Drug-target-disease network

2.3 药物-靶点-疾病网络构建

将药物、有效成分、预测靶点、疾病等信息导入Cytoscape 3.8.2软件构建药物-靶点-疾病网络(图2).该网络由96个节点(Nodes)和404条边(Edges)构成，经软件分析后，按照度值进行排序，前三位为去氧紫草素(度值=45)，邻苯二甲酸二丁酯(度值=35)，蚕豆酮(度值=28).网络中所有成分均对应2个以上靶点，说明五味子治疗ALI是“多成分，多靶点”共同作用的结果.

2.4 PPI网络构建

将交集靶点导入STRING11.0数据库构建初始PPI网络(a)，隐藏无相互作用的节点(RORA、TREM1)后导入Cytoscape 3.8.2软件进行优化.优化后的网络(b)由48个节点，246条边组成，利用MCODE插件找出网络中的核心子网络，选择Score值最大(11.00)的子网络(c)进行分析(图3).该核心子网络由13个节点，66条边组成，对应着13个核心靶点，分别为：ALB、EGFR、HSP90AA1、CASP3、MAPK1、PTGS2、PPARG、NOS3、MAPK8、MAPK14、AR、KDR、CHEK1.

(a) 初始PPI网络 (b) 优化网络 (c) 核心子网络图3 PPI网络 Fig.3 PPI network

2.5 KEGG、GO富集分析

将交集靶点导入DAVID数据库进行KEGG、GO富集分析.分析数据结果按Pvalue值进行排序，并以P<0.001作为阈值进行筛选并分析作图(图4).经过筛选，KEGG富集分析(a)中共有20条信号通路满足要求，结果显示主要涉及PI3K-Akt、FoxO、TNF等信号通路.GO_BP(b)结果共有26个条目，主要涉及对药物的反应、肽基苏氨酸磷酸化、RNA聚合酶II启动子转录的正调控等生物进程；GO_CC(c)结果共有9个条目，主要与细胞外间隙、胞外区、核质等细胞组分有关；GO_MF(d)结果共有12个条目，主要涉及RNA 聚合酶 II 转录因子活性、酶结合、类固醇激素受体活性等分子功能，GO结果均取前10个条目作图.

图4 KEGG和GO(Top10)富集图Fig.4 Enrichment map of KEGG and GO (Top10)

2.6 药物-靶点-通路-疾病网络构建

图5 药物-靶点-通路-疾病网络Fig.5 Drug-target-pathway-disease network

图6 分子对接结果 图7 分子对接模式Fig.6 Results of molecular docking Fig.7 Molecular docking mode

表2 有效成分网络拓扑学参数Tab.2 Active ingredient network topology parameters

表3 靶点(前10)网络拓扑学参数Tab.3 Target (top 10) network topology parameters

根据KEGG结果综合分析，构建药物-靶点-通路-疾病网络.找出通路对应靶点，以及靶点对应有效成分，汇总建立网络文件.导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视性优化(图5).该网络有67个节点和297条边，根据度值、介度及紧密度进行分析，找出起药效作用的主要成分及核心靶点(表2、3).结果显示起药效作用的主要成分为去氧紫草素，蚕豆酮等.核心靶点前10个为：MAPK1、MAPK10、MAPK8、MAPK14、CASP3、GSTP1、AR、GSK3B、BMP2、PTGS2.与PPI网络的前10个核心靶点对比，有6个共同靶点(MAPK1、MAPK8、MAPK14、CASP3、PTGS2、AR).

2.7 分子对接验证

网络互作结果综合分析，选取核心有效成分和靶点进行分子对接(图6、7).一般认为受体和配体的结合能≤-20.92 kJ/mol(-5.0 kcal/mol)说明两者有较好的结合活性，结合能≤-29.288 kJ/mol(-7.0 kcal/mol)可认为其有较强的结合活性[14].将对接结果导入Python-Pymol 2.5.0进行最终的可视化.

3 讨论

ALI具有发病快、病因机理复杂等特点，常见的诱因有化学物质、药物、酒精、自身免疫等，长期发病会导致肝硬化、肝衰竭、肝癌等严重的肝功能疾病.五味子具有悠久的药用历史，是临床常用的保肝药物，现研究已经从五味子中分离了木脂素、多糖、挥发油、三萜等多种化学成分，对五味子治疗ALI方面研究逐渐深入.本研究采用网络药理学结合分子对接的方法，以中药成分靶点和疾病靶点为主要研究对象，探索其治疗过程中可能的活性成分、关键靶点、潜在通路等分子机制，为五味子治疗ALI提供科学依据.

3.1 活性成分分析

筛选出的成分均具有良好的成药性能，共纳入17个活性成分，其中五味子醇甲、醇乙、甲素、乙素、丙素等单体成分均已有相关研究表明其对肝损伤具有保护作用[12-13,15-16]，但在此次筛选中整体重要性靠后，所以本文主要以去氧紫草素和蚕豆酮网络提示关键活性成分进行探讨，邻苯二甲酸二丁酯虽相关程度靠前，但相关研究表明其会导致肝损伤，而非治疗作用[17-18]，所以本研究没有将其纳入讨论，这也提示使用五味子保肝时，可能需要对其进行血药浓度检测，注意邻苯二甲酸二丁酯的入血量及在肝脏组织中的浓度.去氧紫草素属于萘醌类化合物，具有愈伤抗炎、抗菌抗病毒、抗肿瘤、保肝、降血糖、镇静和调节免疫等作用.现研究表明去氧紫草素可通过作用于PI3K-Akt信号通路，在治疗结肠癌、非小细胞肺癌、急性髓系白血病等方面有显著作用[19-21]，筛选发现五味子治疗ALI可能与PI3K-Akt信号通路显著相关，所以去氧紫草素可能通过此途径对ALI发挥治疗作用.蚕豆酮为呋喃乙炔化合物，是豆科植物蚕豆中的植物抗毒素，具有显著的抗菌活性，对肝损伤也具有潜在治疗作用.

分子对接结果显示去氧紫草素和蚕豆酮与关键靶点的结合程度较强，说明本网络药理学预测可靠性较好，去氧紫草素和蚕豆酮可作为今后相关基础及临床研究的对象.

3.2 靶点分析

现有研究表明，五味子可能通过抗炎、抗氧化、调控核受体、抑制肝星状细胞活化、抑制肝细胞凋亡，促进肝再生、调节细胞色素P450酶、调节免疫等机制，作用于相关靶点防治肝脏疾病.预测的关键靶点包含丝裂原活化蛋白激酶1/8/14(MAPK1/8/14)、胱天蛋白酶3(CASP3)及环氧合酶2(PTGS2).MAPK信号通路是一种重要的信号转导系统，是哺乳动物体内广泛存在的信号通路，其能将细胞外刺激信号转导至细胞核内，诱导基因转录并引起一系列病理生理变化[22]，MAPK通路中各个亚组在急性肝损伤发病过程中均起重要的中间作用[23].相关研究发现，保肝中药活性成分白术内酯Ⅰ、藤茶总黄酮等均可通过调控MAPK通路，从而减轻不同程度的肝损伤，改善肝功能[24-25]；CASP3属Caspases家族蛋白，与细胞凋亡有关，Thapaliya S等[26]在研究饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎模型中，发现CASP3失活可防止肝细胞死亡并改善肝纤维化，Ma等[27]研究发现熊果酸在体内通过不可逆地抑制CASP3从而减轻酒精性肝损伤；PTGS2是前列腺素生物合成中的关键酶，可促进血管生成，抑制细胞凋亡，研究发现保肝药扶正养肝合剂治疗药物性肝损伤时会下调PTGS2 mRNA水平[28]，白芍-甘草药对配伍可能发挥协同作用，可通过靶蛋白PTGS2调节脂解脂肪细胞，在非酒精性脂肪肝的发展进程中具有保护肝脏的作用[29].AR又称雄激素受体，属于核受体超家族中的类固醇受体，有研究表明AR高表达与CCL4诱导的急性肝损伤密切相关，其作用可能依赖于雄激素水平[30].

3.3 富集通路分析

KEGG富集通路结果显示五味子治疗ALI的过程可能与PI3K-Akt、FoxO、TNF等信号通路有关.PI3K-Akt信号通路是细胞内非常重要的信号转导途径，在细胞的生长、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等过程中发挥着极其重要的生物学功能，Wang等[31]在对丹酚酸A减轻CCl4诱导的肝损伤的研究中发现，在修复肝损伤的过程中，PI3K/AKT/mTOR通路信号级联反应会被抑制.FoxO属于叉形头转录因子的O亚型，可响应多种外部刺激(如生长因子、胰岛素、营养水平和氧化应激)而激活，能够控制多种特定的基因表达程序.同时，FoxO也是PI3K-Akt信号通路的下游转录因子之一，可被PI3K-Akt信号通路中相关蛋白磷酸化，从而被不可逆的抑制并移出细胞核，相关研究[32]表明FoxOs在维持肝脏代谢和细胞稳态方面起着关键作用，FoxOs的失调可能与肝细胞凋亡进而引起肝损伤有关.TNF又称肿瘤坏死因子，它参与全身炎症反应，是组成急性期反应的细胞因子之一，Lopetuso等[33]综述了TNF-α对肝脏的有害作用及潜在益处，表明其在治疗肝脏疾病时起到重要的调控作用.

综上所述，通过使用网络药理学联合分子对接的方法，并将各网络及数据库进行综合讨论分析，对五味子通过“多成分、多靶点、多途径”治疗ALI的分子作用机制进行了充分的探讨，方法较为完整，且筛选结果大多有相关文献支持，后续还需对预测结果进行细胞或动物实验，为相关基础及临床研究提供新的思路与参考.