磷酸丝氨酸磷酸化酶在肝细胞癌中的表达及其促进增殖和转移的作用机制

王可，李建波，曹晓菲

（1.达州职业技术学院，四川达州635000；2.达州职业技术学院附属医院外科，四川达州635000；3.中国人民解放军空军军医大学第二附属医院肿瘤科，陕西西安710038）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC） 是原发性肝癌的主要亚型，是一种高度致命的恶性肿瘤，具有早期诊断困难、极易复发和转移等特点，在全球癌症相关死亡原因排名中位列第四[1-3]。尽管在诊断过程和治疗方面取得了重大进展，但在过去5年里，HCC 的病死率依旧居高不下[4]。因此，迫切需要研究HCC 细胞增殖和转移的作用机制。

目前研究显示，HCC 是由许多基因表达失调介导的。如凝缩蛋白复合物亚基G2（NCAPG2）在HCC 组织中表达上调，促进HCC 细胞增殖和转移[5]。Huang 等[6]报道过表达核糖体结合蛋白2（RPN2）可促进HCC 细胞增殖、转移、侵袭和上皮-间充质转化。磷酸丝氨酸磷酸化酶（PSPH）属于磷酸转移酶亚家族，位于染色体7p11.2 上，参与细胞增殖所必需的L-丝氨酸的合成途径[7]。既往研究表明，异常表达的PSPH 与多种恶性肿瘤相关，包括乳腺癌[8]和非小细胞肺癌[9]。然而PSPH 在HCC进展中的作用及其潜在的机制研究十分稀少，仍需进一步完善。

本研究通过分析PSPH 在HCC 组织和细胞中的表达水平及过表达或沉默PSPH 对HCC 细胞行为的影响，从而阐明其在HCC 中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 临床样本

选取2012年7月—2016年8月达州职业技术学院附属医院手术切除的20 例HCC 患者的癌组织及其癌旁组织进行研究。所有患者均提供了书面知情同意书。本研究得到了达州职业技术学院附属医院科研伦理委员会的批准。

1.2 试剂与仪器

DMEM 培养基、青霉素、链霉素和胎牛血清购自Invitrogen 公司。二甲亚砜（DMSO）购自上海阿拉丁公司。CCK‐8 试剂盒和EdU 试剂盒购买于中国锐博公司。SYBR PremixEx Taq II 试剂盒和PrimeScriptTMRT Master Mix 反转录试剂盒购自Takara公司。BCA 蛋白检测试剂盒购自碧云天公司。ImageQuanTMLAS 4000 和ChemiDocTMXRS +分别购买于GE 和Bio‐Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养将来自中国科学院生物科学研究所的人正常肝细胞系（HL‐7702）和人HCC 细胞系（HepG2、Huh‐7 和HCCLM3）培养于富含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 µg/mL 链霉素和100 U/mL 青霉素的DMEM 培养基中，并置于37 ℃、含有5%的CO2，95%湿化的培养箱进行孵育。

1.3.2 CCK‐8 法检测细胞增殖将HepG2 细胞以每孔1×103个接种于96 孔培养板中。分别经过24、48、72 和96 h 的孵育后，向每孔加入100 µL CCK‐8 溶液。随后将培养板置于培养箱继续孵育4 h，通过Multiscan‐Go 分光光度计 （Thermo Fisher Scientific）检测450 nm 处的吸光值。

1.3.3 EdU 法检测细胞增殖采用EdU 试剂盒进行检测。将每个孔中接种约1×103个细胞，加入50 µmol/L EdU 试剂于HepG2 转染细胞中培养2 h后，PBS 洗涤2 次，然后用4% 多聚甲醛固定30 min。随后加入100 µL 新鲜Apollo 染色反应液对细胞进行染色，100 µL Hoechst 33342 染色细胞核，最后通过荧光显微镜（Olympus BX51）分析细胞活力。

1.3.4 Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭采用涂有基质凝胶的Transwell 室（Millipore）检测细胞侵袭。将1×104个HepG2 细胞接种到含有无血清培养基的上腔中，而在下腔中加入含有10%血清的培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱孵育24 h 后，使用4%多聚甲醛固定下腔细胞，0.1%结晶紫染色，并在倒置显微镜下计算侵袭细胞数量（Olympus）。

1.3.5 Western blot采用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞，提取蛋白。通过BCA 蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。蛋白经SDS‐PAGE 分离后转移至PVDF 膜上，室温下使用脱脂牛奶封膜1 h，然后与一级抗体（PSPH、MMP‐9、CCND1、Ki‐67、LC3‐II/LC3‐I、p62、NF‐κB p65）4 ℃过夜孵育，再加入二抗（HRP 标记的羊抗兔IgG）室温孵育1 h。最后，利用ImageQuanTMLAS 4000 和ChemiDocTMXRS +对条带进行检测和定量。

1.3.6 qRT‐PCR转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA。采用SYBR PremixEx Taq II 试剂盒在7900HT system 进行扩增。具体程序如下：95 ℃10 s，95 ℃5 s 共40 个循环；60 ℃30 s,72 ℃15 s，GAPDH 作为内参。采用2-ΔΔCt方法检测目标基因的相对表达水平。

1.3.7 免疫荧光将细胞接种在聚赖氨酸涂层的盖玻片上，培养24 h，4% 多聚甲醛固定20 min，0.2% Triton‐X‐100 通透10 min。随后使用一级抗体（NF‐κB p65），二级抗体（HRP 标记的羊抗兔IgG）和DAPI 依次与细胞孵育。采用Olympus 荧光显微镜观察拍摄图像。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。所有数据均以均数±标准差（±s）表示。两组之间的差异通过t检验法分析，多组间的差异通过单因素方差分析（ANOVA）计算。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PSPH在HCC组织和细胞中表达

Western blot 结果显示，与癌旁组织比较，HCC组织中PSPH 基因表达明显上调（P＜0.05）（图1A）。qRT‐PCR 结果显示，与人正常肝细胞HL‐7702 比较，HCC 细胞系HepG2、Huh‐7 和HCCLM3 中的PSPH 表达均明显增加（均P＜0.05）（图1B）。

图1 PSPH 在组织和细胞的表达A：Western blot 检测PSPH 在HCC 患者组织和癌旁组织中的表达；B：qRT‐PCR 检测PSPH在HCC细胞系（HepG2，Huh‐7，HCCLM3）及人正常肝细胞系（HL‐7702）中的表达Figure 1 PSPH expressions in tissue and cellsA:PSPH expressions in HCC and adjacent tissue determined by Western blot analysis; B:PSPH expressions in HCC cell lines(HepG2,Huh‐7,HCCLM3)and normal hepatic cell line(HL‐7702)determined by qRT‐PCR method

2.2 过表达PSPH对HepG2细胞增殖和侵袭的影响

为了研究PSPH 在HCC 发展过程中的生物学作用，通过转染PSPH 过表达质粒（pcDNA‐PSPH）至HepG2 细胞中上调PSPH 的表达。qRT‐PCR 结果显示，与空白质粒转染组（vector 组）比较，过表达PSPH 可明显提高HepG2 细胞中PSPH 的表达水平（P＜0.05）（图2A）；CCK‐8 和EdU 实验结果显示，过表达PSPH 后，HepG2 细胞增殖能力明显提高（图2B-C）（均P＜0.05）；Transwell 侵袭实验结果显示，过表达PSPH 后细胞侵袭能力明显增强（P＜0.05）（图2D）；Western blot 结果显示，过表达PSPH 后，细胞增殖标记蛋白CCND1 和Ki‐67 的表达均明显上调（均P＜0.05）（图2E）。

图2 PSPH过表达对HepG2细胞增殖和转移的影响A：qRT‐PCR检测转染pcDNA‐PSPH后的转染效率；B：CCK‐8法测定转染后不同时间点细胞增殖情况；C：EdU 法测定HepG2 细胞增殖；D：Transwell 细胞侵袭实验测定细胞侵袭；E：CCND1和Ki‐67蛋白水平的检测Figure 2 Influence of PSPH overexpression on proliferation and metastasis of HepG2 cellsA:Transfection efficiency of pcDNA‐PSPH transfection determined by qRT‐PCR;B:Proliferation activities at different time points determined by CCK‐8 assay; C:Proliferation of HepG2 cells determined by EdU assay; D:Cell invasion ability determined by Transwell assay;E:Determination of CCND1 and Ki‐67 protein expressions

2.3 敲低PSPH对HepG2细胞增殖和侵袭的影响

qRT‐PCR 结果显示：转染PSPH shRNA 后，HepG2 细胞中PSPH 的表达较阴性对照组（sh‐NC组）明显降低（P＜0.05）（图3A）；CCK‐8 和EdU 实验结果显示，敲低PSPH 后，HepG2 细胞增殖能力明显降低（均P＜0.05）（图3B-C）；Transwell 侵袭实验结显示，敲低PSPH 后，HepG2 细胞侵袭能力明显下降（P＜0.05）（图3D）；Western blot 结果显示，敲低PSPH 后，CCND1 和Ki‐67 蛋白的表达均明显下调（均P＜0.05）（图3E）。

图3 敲低PSPH对HepG2细胞增殖和转移的影响A：qRT‐PCR检测转染PSPH shRNA后的PSPH表达；B：CCK‐8法测定转染后不同时间点细胞增殖情况；C：EdU 法测定HepG2 细胞增殖；D：Transwell 细胞侵袭实验测定细胞侵袭；E：CCND1和Ki‐67蛋白水平的检测Figure 3 Influence of PSPH knockdown on proliferation and metastasis of HepG2 cellsA:PSPH expression after transfection of PSPH shRNA determined by qRT‐PCR; B:Proliferation activities at different time points determined by CCK‐8 assay; C:Proliferation of HepG2 cells determined by EdU assay; D:Cell invasion ability determined by Transwell assay; E:Determination of CCND1 and Ki‐67 protein expressions

2.4 PSPH对HepG2细胞自噬的影响

过表达和敲低HepG2 细胞中PSPH 后，LC3‐II/LC3‐I 和p62（自噬进程中主要指标）表达均发生明显变化。过表达PSPH 后，LC3‐II/LC3‐I 表达上调而p62 表达下调；敲低PSPH 后，LC3‐II/LC3‐I 表达降低而p62 表达增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图4）。

图4 PSPH对HepG2细胞自噬的影响A：过表达PSPH后相关蛋白的表达；B：敲低PSPH后相关蛋白的表达Figure 4 Effect of PSPH on autophagy in HepG2 cellsA:Expressions of autophagy‐related proteins after PSPH overexpression;B:Expressions of autophagy‐related proteins after PSPH knockdown

2.5 PSPH对NF‐κB/MMP‐9信号通路的影响

免疫荧光结果显示：与vector 组比较，过表达PSPH 后NF‐κB p65 蛋白在细胞核中明显富集，而NF‐κB 通路抑制剂shikonin 可减少PSPH 过表达对NF‐κB p65 蛋白核转位的促进作用，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图5A）；与sh‐NC 组比较，敲低PSPH 可明显抑制细胞核中NF‐κB p65 的表达，PSPH 明显促进NF‐κB p65 蛋白在细胞核中的表达，而NF‐κB 通路激动剂TNF‐α 可逆转PSPH 敲低对NF‐κB p65 核转位抑制作用，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图5B）。Western blot 结果显示，HepG2 细胞中的MMP‐9 的表达明显上调，而shikonin 可逆转PSPH 过表达对MMP‐9 的上调作用，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图5C）；敲低PSPH 可明显下调MMP‐9 表达，而TNF‐α 可逆转PSPH 敲低对MMP‐9 表达的下调作用，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图5D）。

图5 PSPH 对NF‐κB/MMP‐9 信号通路的影响A-B：免疫荧光检测PSPH 过表达或敲低后p65 亚单位核转位情况；C-D：Western blot 检测PSPH过表达或敲低后MMP‐9的表达水平Figure 5 Effect of PSPH on NF-κB/MMP-9 pathwayA-B:Nuclear translocation of the p65 submit after PSPH overexpression or knockdown determined by fluorescence staining; C-D:Expression levels of MMP‐9 after PSPH overexpression or knockdown determined by Western blot analysis

3 讨论

HCC 是发生率和病死率较高的恶性肿瘤，其发生机制与多种基因转录和信号转导密切相关。无限增殖和转移是癌症的主要特征，也是HCC 导致死亡的主要原因。因此，迫切需要识别潜在的治疗靶点，了解HCC 进程中的潜在分子机制。

已有研究报道PSPH 在多种恶性肿瘤细胞的发生发展中扮演重要的角色。例如，PSPH 通过激活Akt/AMPK 通路促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭[9]。Michael 等[10]发现PSPH 在皮肤鳞状细胞癌中高表达，敲低PSPH 抑制鳞状上皮细胞的增殖。在结肠癌中，通过抑制PSPH 的表达能增强5-氟尿嘧啶的抗癌疗效[11]。临床研究表明，高表达的PSPH 在乳腺癌[8]、子宫内膜癌[12]和甲状腺癌[13]中是一种有前途的预后生物标志物。既往研究中有关PSPH 在HCC 中的作用机制研究极其稀少。Sun等[14]表明在HCC 患者中，PSPH 与病死密切相关。在缺乏营养的环境中，c‐Myc 激活丝氨酸生物合成途径增加PSPH 的表达，从而促进HCC 进展。本研究结果显示PSPH 在HCC 组织和细胞中表达上调，过表达PSPH 可显著促进HCC 细胞增殖和侵袭，而下调PSPH 显著抑制细胞增殖和侵袭。进一步研究表明，PSPH 通过增LC3‐II/LC3‐I 和减少p62 的表达，诱导自噬。自噬的特征是通过双层膜或多层膜的自噬小泡包裹细胞质和细胞器，随后被传递到细胞中进行降解。Gao 等[15]表明激活AMPK/mTOR 通路可诱导细胞自噬，从而促进HCC 细胞的侵袭和迁移。Zhang 等[16]表明PSPH 通过激活LKB1 和TAK1调节AMPK/mTOR/ULK1 通路促进HCC 细胞增殖和迁移，诱导自噬。此外，TAK1 通过激活NF‐κB 信号，增强卵巢癌细胞的致癌能力[17]。Tey 等[18]表明，通过上调TAK1 激活NF‐κB 信号通路促进HCC 的发生和转移。随后，本研究发现PSPH 通过调节NF‐κB p65 的表达促进MMP‐9 的表达。

MMP‐9 来源于基质金属蛋白酶家族，主要通过降解细胞外基质促进癌细胞向邻近正常细胞侵袭[19-20]。众所周知，MMP‐9 等因子在恶性肿瘤侵袭、转移和血管形成过程具有不可或缺的地位[21-23]。既往研究表明，MMP‐9 在头颈部鳞状细胞癌高表达[24]，并与淋巴转移和喉癌呈正相关[25-26]。目前研究表明，HCC 中过表达PSPH 后MMP‐9 表达上调，NF‐κB p65 表达水平升高。当加入NF‐κB 通路抑制剂后，MMP‐9 表达降低。敲低PSPH 后观察到与上述相反的现象。已有证据表明，NF‐κB p65与频发的HCC 肿瘤细胞侵袭转移行为密切相关[27]。此外，已有研究表明MMP‐9 启动子包含与NF‐κB p65 蛋白结合位点同源的基序，通过上调NF‐κB p65，促进MMP‐9 的转录和表达，从而导致HCC 细胞侵袭和转移[28-30]。本研究首次证明，在HepG2 细胞中PSPH 通过NF‐κB 通路诱导MMP‐9 表达升高，可能部分解释了PSPH 介导HepG2 细胞侵袭行为。

综上所述，本研究揭示了PSPH 是一个参与HCC 增殖、转移和自噬的重要致癌基因。PSPH 可以激活NF‐κB 信号通路调节MMP‐9 的表达促进HepG2 细胞增殖和转移，为了解HCC 进展提供了理论基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。