长枝木霉T6与阿维菌素复配对禾谷孢囊线虫的室内毒杀效果

吉宝丽毛维兴张树武徐秉良

(甘肃农业大学 植物保护学院,甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室,兰州 730070)

小麦禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)是一种危害禾谷类作物和禾本科牧草根部的土传病原线虫,属于固着性寄生线虫,在农业生产中造成严重的产量损失[1]。该线虫于1874年在德国被首次发现,目前已经在全球近40个国家的小麦种植区发生和危害[2];在澳大利亚的小麦种植区,导致粮食减产23%～89%,每年造成高达7 000万美元的经济损失[3];在西班牙重发区高达90%[4]。在中国,该病原线虫于1989年在湖北首次被发现,目前已在青海、山西、江苏、河北等16个省(市)广泛分布[5-6],危害面积达小麦种植面积的80%,导致小麦产量损失达20%～70%[7-8]。另外,禾谷孢囊线虫发生危害时造成小麦根部损伤,增加了土壤中植物病原菌侵染的机会,进一步加重小麦产量的损失[9]。因此,小麦禾谷孢囊线虫病已成为制约中国小麦生产和粮食安全的重要因素。

当前,在农业生产中,主要采用化学防治(如米乐尔和好年冬)以及抗耐病品种等措施对植物病原线虫进行防治[10]。但是,目前中国大面积种植的小麦品种抗性较差,同时,抗耐性品种的选育是一项长期的战略[11-12];化学防治效果可达90%以上,但其具有土壤残留高和毒性大,以及危害土壤中有益微生物等缺陷,且随着人们环保和安全意识的提高,化学农药的使用正在不断减少[13]。因此,寻找绿色高效生物农药防治禾谷包囊线虫已成为必然的趋势。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一种丝状真菌,其特点是分布广泛、抑菌谱广、环境适应强,目前已被证实对立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、腐霉菌(Pythiumspp.)、镰刀菌(Fusariumspp.)等多种植物病原菌具有拮抗作用[14-15]。同时,木霉菌对植物病原线虫也有一定的防治效果,如使用拟康氏木霉(T.pseudokoningii)防治根结线虫能够显著降低卵的孵化率,同时对2龄幼虫也具有较强的毒杀作用[16]。张树武等[17]研究表明,长枝木霉菌(T.longibrachiatum)分生孢子悬浮液对小麦禾谷孢囊线虫卵具有明显的寄生和致死作用,从而降低2龄幼虫的数量。阿维菌素是一种广谱、高效、安全、稳定的神经毒剂类生物农药,对农业上许多害虫包括植物寄生线虫具有一定的防治效果,且在土壤中降解迅速,无累积、无残留[18]。张同庆等[19]研究表明,1%阿维菌素对铁棍山药根结线虫的防效为60.54%。但是在农业生产中单一使用阿维菌素容易引起小麦禾谷孢囊线虫的抗药性和效果不稳定等问题[20]。

生防真菌与生物农药混配使用,不仅能够提高防治效果,还能起到扩大防病谱、延缓线虫抗药性等作用[21-22]。因此,本试验以禾谷孢囊线虫2龄幼虫为研究对象,测定长枝木霉T6、阿维菌素及其不同比例混用对其室内毒杀效果,以期获得一种高效的复配型生物农药,为新型生防制剂的开发与应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 甘肃农业大学植物病毒学和分子生物学实验室提供在PDA 培养基上生长的长枝木霉T6菌株,于2016年保藏于中国科学院微生物研究所,保藏号为CGMCC No.13183。

1.1.2 供试土样 采用五点取样法于2015年7月在河南省小麦禾谷孢囊线虫发生较严重的地块采集土样,取样时先去除土块的表层干土,然后取0～20 cm 层的土壤,将多点土样混匀,备用。

1.1.3 供试药剂 有效成分含量为1.8%的阿维菌素乳油,浙江世佳科技有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 禾谷孢囊线虫2龄幼虫分离 采用“漂浮法”[23]分离孢囊。向河南采集的病田土样中加入一定量的自来水,充分搅拌至土样全部溶解,静置2～3 min即为土壤悬浮液,利用嵌在65目网筛中的25目网筛缓慢过滤悬浮液,重复3次,以防止孢囊被过滤掉。去掉25目网筛,用干净的水缓慢冲去65目网筛中的泥沙,将剩余物倒入垫有双层擦镜纸的漏斗内。然后将过滤后的剩余物移入干净的培养皿中,用竹签在体式显微镜下挑取新鲜、饱满的棕色孢囊,置于4 ℃冰箱,备用。挑取的孢囊用1% NaCl O 溶液消毒1 min,并用无菌水冲洗6次。然后将消毒的孢囊放入垫有擦镜纸的线虫分离器中,置于15～20℃的恒温培养箱中孵化13～22 d,每天收集孵化的2龄幼虫,置于显微镜下利用血球计数板配制浓度为200 m L-1的2龄幼虫悬浮液,4 ℃下保存,备用。

1.2.2 长枝木霉菌T6菌株孢子悬浮液的制备

取25℃恒温培养箱培养6 d的长枝木霉T6菌株PDA 平板,加入100μL Tween 80及5 m L无菌水,用无菌毛刷将孢子刷入无菌的10 m L 离心管中充分震荡,即获得分生孢子悬浮液,利用血球计数板配制使终浓度为2.0×107cfu·m L-1,备用。

1.2.3 阿维菌素溶液的制备 将1.8%的阿维菌素乳油用无菌水分别配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg·m L-1溶液,备用。

1.2.4 长枝木霉T6孢子悬浮液与阿维菌素溶液复配剂的制备 按体积比为1∶1、2∶1、3∶1的比例分别复配浓度为2.0×107cfu·m L-1的长枝木霉T6分生孢子悬浮液和上述5个浓度的阿维菌素溶液,充分震荡使其混合均匀,备用。

1.2.5 长枝木霉与阿维菌素及其复配对2龄幼虫毒杀作用的测定 利用无菌的96孔细胞培养板测定单剂和复配剂的杀线活性,每孔中先加入10μL浓度为2×102m L-1的2龄幼虫悬浮液,再分别加入90μL长枝木霉T6与阿维菌素复配剂、单一长枝木霉T6孢子悬浮液和不同浓度的阿维菌素溶液,以加入等量的无菌水作为对照处理。每个处理16个重复,置于25 ℃恒温培养箱中培养,每隔24 h在显微镜下观察并记录线虫的死亡虫数,根据记录数据计算其校正死亡率、致死中量并进行方差分析。

死亡率=死亡2龄幼虫数量/供试2龄幼虫数量×100%

校正死亡率=(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100%

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 2017对试验数据进行统计分析,并利用SPSS 19.0进行方差分析,差异显著性检验采用Duncan氏新复极差法。

2 结果与分析

2.1 长枝木霉T6菌株孢子悬浮液对线虫毒杀活性

长枝木霉T6菌株孢子悬浮液处理禾谷孢囊线虫2龄幼虫表现出较好的毒杀活性,并且随处理时间的增大活性增强,与对照相比存在显著差异(表1)。

表1 长枝木霉T6菌株孢子悬浮液对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀效果Table 1 Toxic effect of T.longibrachiatum T6 spore on the second stage juveniles of H.avenae

2.2 不同浓度阿维菌素溶液对线虫毒杀活性

阿维菌素溶液对2龄幼虫具有较好的毒杀活性,随着阿维菌素浓度和处理时间的增加而不断增强,且不同浓度对2龄幼虫的致死作用存在显著差异。由毒力回归方程和LC50可知,阿维菌素溶液对2龄幼虫的致死作用与其浓度以及处理时间呈正相关(表2)。

表2 不同浓度阿维菌素对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀效果Table 2 Toxic effect of different concentrations of Avermectin on second stage juveniles of H.avenae

2.3 长枝木霉T6菌株和阿维菌素复配溶液对线虫毒杀活性

长枝木霉T6菌株孢子悬浮液与阿维菌素溶液复配后对禾谷孢囊线虫2龄幼虫具有较强的毒杀作用,其活性明显高于单一木霉菌株或单一阿维菌素,显著提高单一木霉或单一阿维菌素对2龄幼虫的毒杀效果。浓度为2.0×107cfu·m L-1的长枝木霉T6 菌株孢子悬浮液与0.5μg·m L-1的阿维菌素按体积比1∶1 复配处理2龄幼虫48 h后的死亡率高达96.30%,校正死亡率为96.30%(表3)。由毒力回归方程和LC50可知,长枝木霉孢子悬浮液与不同浓度阿维菌素复配对2龄幼虫的毒杀作用与阿维菌素浓度以及处理时间呈正相关。

表3 长枝木霉与阿维菌素1∶1混剂对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀作用Table 3 Toxic effect of T.longibrachiatum and Avermectin 1∶1 mixture on second stage juveniles of H.avenae

浓度为2.0×107cfu·m L-1的长枝木霉T6菌株孢子悬浮液与0.5μg·m L-1的阿维菌素按体积比2∶1复配处理2龄幼虫24 h和48 h后的死亡率分别为64.44%与91.24%(表4);两者按体积比3∶1复配处理2龄幼虫24 h和48 h后的死亡率分别为74.29%与91.07%(表5)。试验结果表明,长枝木霉T6菌株孢子悬浮液与阿维菌素溶液按不同体积比复配后对禾谷孢囊线虫2龄幼虫均具有较强的毒杀作用,与单一木霉或单一阿维菌素处理2龄幼虫的毒杀效果相比,均有显著提高,表明长枝木霉孢子悬浮液与阿维菌素有很好的兼容性,而且当阿维菌素浓度为0.5 μg·m L-1时,长枝木霉孢子悬浮液与其按1∶1、2∶1、3∶1的体积比混合处理2龄幼虫24 h,对线虫毒杀活性有显著差异,而在处理48 h后毒杀活性无显著差异。

表4 长枝木霉与阿维菌素2∶1混剂对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀作用Table 4 Toxic effect of T.longibrachiatum and Avermectin 2∶1 mixture on second stage juveniles of H.avenae

表5 长枝木霉与阿维菌素3∶1混剂对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀作用Table 5 Toxic effect of T.longibrachiatum and Avermectin 3∶1 mixture on second stage juveniles of H.avenae

3 结论与讨论

单一阿维菌素和单一长枝木霉T6菌株孢子悬浮液对禾谷孢囊线虫2龄幼虫均具有较好的毒杀效果,且随处理浓度和时间的增大效果增强;长枝木霉T6孢子悬浮液与阿维菌素有很好的兼容性,长枝木霉T6菌株孢子悬浮液与不同浓度阿维菌素溶液按不同体积比复配后对禾谷孢囊线虫2龄幼虫均具有较强的毒杀作用,毒杀效果显著优于单一木霉或单一阿维菌素。

马金慧等[24]利用哈茨木霉发酵液原液处理南方根结线虫2龄幼虫,48 h后的校正死亡率达到100%;本试验中,长枝木霉分生孢子悬浮液处理2 龄幼虫48 h 后,线虫的校正死亡率为71.43%,校正死亡率的差异可能与生防真菌的种类、杀线机制以及病原线虫的不同等有关[25]。

通过将不同作用机制的生防菌与生物农药复配后进行植物病原菌的防治,能够显著提高防治效果,同时减少农药的使用并延长农药的持效期。杨波等[26]利用生防真菌淡紫紫孢菌颗粒剂与阿维菌素复配防治黄瓜根结线虫,复配后阿维菌素的用量显著降低,且有明显的增效作用。木霉菌与阿维菌素均与环境相容性好,复配使用生产成本低,成分多样,线虫不易产生抗药性,具有扩大防治谱和协同增效等作用[18,27]。在本试验中,长枝木霉T6 菌株孢子悬浮液与阿维菌素溶液以1∶1体积比复配时,对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的防效达96.3%,所需的长枝木霉T6菌株分生孢子悬浮液用量少,生产成本低,具有良好的应用前景。