血根碱对6种非靶标生物的安全性评价

刘 伟师宝君冯俊涛姜军侠沈莹华段 鹏

(1.陕西省农业检验检测中心,西安 710003;2.西北农林科技大学 植物保护学院,陕西 杨凌 712100;3.陕西先农生物科技有限公司,西安 710018)

农药既是农业所必须的生产资料,又是一类有毒物质,如何在有效控制有害生物的同时,最大限度降低农药对环境非靶标生物的影响,一直是人们在农药使用过程中面临的难题。随着“生态保护”“绿色发展”成为时代主题,中国对农药的安全性管理日趋严格。因此,研究农药对环境非靶标生物的毒性与危害性,是新农药开发中不可缺少的环节[1]。农药对非靶标生物的影响主要是对环境有益生物而言[2]。植物源农药虽然具备来源天然的先天优势,但并非所有的植物性化合物都具有对人、畜、非靶标生物的安全性,如烟草、狼毒等对高等动物具有较高的毒性,鱼藤酮对鱼类的毒性极高等[3-4]。血根碱是多年生草本植物博落回中提取的异喹啉类生物碱,是一种具杀虫、杀菌活性的植物源农药[5]。目前,农药领域对血根碱的研究多集中在生物活性、作用机理、哺乳动物毒性等方面[6-7],其对非靶标生物的毒性鲜见报道。为评价血根碱对非靶标生物的安全性,本研究参考相关文献[8-13],测定血根碱对蜂、鸟、蚕、鱼、溞、藻的毒性,以期为血根碱相关农药产品开发和安全合理使用提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试生物与药剂

日本鹌鹑(Coturnixjaponica):咸阳孵化厂提供,20 日龄;家蚕(Bombyx mori):秋丰×白玉,西北农林科技大学蚕桑研究所提供,3 龄幼虫;蜜蜂:意大利工蜂(Apismellifera),杨凌示范区大寨乡养蜂专业户提供,成蜂;斑马鱼(Brachydoniorerio):体长为1.7～2.5 cm,体质量0.2～0.3 g,承载量<1.0 g鱼/L,西安市草滩第一渔场提供;大型溞(Daphnia magnaStraus):溞种由中国科学院水生生物研究中心提供,孤雌繁殖;斜生栅藻(Scenedesmusobliquus):藻种由中国科学院生态环境研究所淡水藻种库提供;40%血根碱母药试样由陕西先农生物科技有限公司提供。

为充分保障试验动物福利,参试动物均按《GB/T 3170-2004化学农药环境安全评价试验准则》《NY/T 1906-2010 农药环境安全评价良好实验室规范》驯养,试验结束时,所有给药动物,鸟采取CO2麻醉,鱼和溞采取电击,蜂和蚕采取先乙醚麻醉后冷冻安乐死。

1.2 试验方法

1.2.1 对鸟类的毒性 将40%血根碱母药用蒸馏水稀释成38.7、46.4、55.7、66.6、80.0 g/L 5个质量浓度处理药液,选用驯养好的体质量为(100±10)g 的日本鹌鹑,每组10 只,雌雄各5只,用移液管按100 g体质量鹌鹑灌药1 m L供试药液,对鹌鹑直接经口灌胃染毒,得387、464、557、666、800 mg/kg 5个组处理。鹌鹑经口染毒后,投放入观察用鸟笼,正常饲喂。于药后24、48、72、96、120、144、168 h 观察各组受试鹌鹑中毒症状与死亡情况,记录死亡数,每隔24 h取出死亡鹌鹑。设置空白对照,对照组和处理组均不设重复。

1.2.2 对家蚕的毒性 将40%血根碱母药用蒸馏水稀释成100、200、400、800、1 600 mg/L 5个质量浓度处理药液,把新鲜桑叶分别用各质量浓度药液完全浸渍10 s后,取出,自然晾干,放入相应标记并垫有滤纸片的9 cm 培养皿中,每培养皿接入20头2龄起幼蚕,任其自由取食,测定对家蚕的胃毒毒性。于药后24、48、72、96 h观察各组受试家蚕中毒症状与死亡情况,记录死亡数,每隔24 h取出死亡家蚕。设置空白对照,每处理3次重复,每次重复20头蚕。

1.2.3 对蜜蜂毒性 经口毒性:将40%血根碱母药用蒸馏水稀释成1.25、2.5、5、10、20 g/L 5个质量浓度药液,分别和100%蔗糖水按体积比1∶1混合,得质量浓度为0.625、1.25、2.5、5、10 g/L的饲喂染毒蔗糖水,作为处理溶液。把供试蜜蜂放入CO2麻醉装置,麻醉后(约2 min)引入试验笼中,在饲喂器中加入100μL染毒蔗糖水处理溶液(蜜蜂理论取食剂量分别为每蜂6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg,饲喂试验蜜蜂,4 h后去掉含药液饲喂器(称量饲喂前后饲喂器质量,计算蜜蜂实际取食药剂质量),换用无毒50%蔗糖水持续饲喂,直到试验结束。于试验开始后24、48 h 观察各组受试蜜蜂中毒症状与死亡情况。设置空白对照,每处理3 次重复,每次重复10只蜜蜂。

接触毒性:将40%血根碱母药用丙酮稀释成5、10、20、40、80 g/L 5个质量浓度处理药液,把供试蜜蜂放入CO2麻醉装置,麻醉后(约2 min)取出,用微量点滴仪吸取各质量浓度药液,于蜜蜂中胸背板处点滴1μL,蜜蜂接触剂量分别为5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/蜂,待蜂身晾干后,将受毒蜜蜂转移到试验观察用蜂笼内,用50%蔗糖水饲喂试验蜜蜂,直到试验结束。于药后24 h和48 h 观察各组受试蜜蜂中毒症状与死亡情况。设置空白和丙酮对照,每处理3次重复,每次重复10只蜜蜂。

1.2.4 对斑马鱼的毒性 将40%血根碱母药用曝气自来水稀释成0.500、0.600、0.720、0.865、1.040 mg/L 5个质量浓度的处理药液,每烧杯加入2 L 药液,分别投入10尾斑马鱼,采用半静态法,每隔24 h更换1次药液,直到试验结束。于试验开始后24、48、72、96 h观察各组受试斑马鱼中毒症状与死亡情况,及时打捞死鱼。设置曝气自来水空白对照,对照组和处理组均不设重复。

1.2.5 对大型溞的毒性 将40%血根碱母药用曝气自来水稀释成0.20、0.30、0.45、0.67、1.00 mg/L 5个质量浓度的处理药液,每烧杯加入100 m L药液,分别投入10只幼溞,采用静态法,试验期间不曝气、不喂食,直到试验结束。于试验开始后24和48 h观察各组试验溞中毒症状与活动受抑制情况。设置曝气自来水空白对照,每处理4次重复,每次重复10只幼溞。

1.2.6 对斜生栅藻的毒性 将40%血根碱母药用无菌水生培养基稀释成60、120、240、480、960 μg/L 5个质量浓度的处理药液,再与1.0×104个/m L浓度的藻液按比1∶1等体积混合,得到30、60、120、240、480μg/L 5 组质量浓度的处理藻液,按每瓶100 m L 藻液加入150 m L 锥形瓶中,常规培养,直到试验结束。于试验开始后24、48、72 h观察各组试验藻生长受抑制情况。设置培养基空白对照,每处理3次重复,于试验开始时仪器测定各组藻液的实际血根碱质量浓度,用于结果计算。

1.3 数据分析

对半数致死浓度(LC50)、半数致死剂量(LD50)和半数有效浓度(EC50)、生长率抑制有效浓度(ErC50)、生物量抑制有效浓度(EyC50)及置信限采用SPSS 18.0 软件中概率回归分析计算。

2 结果与分析

2.1 血根碱对鸟类的毒性

鹌鹑经口染毒后,中毒症状为站立不稳、精神萎靡、摄食摄水减少。连续观察1周,结果表明,鹌鹑死亡率与给药质量浓度呈正相关,且自给药后第3 天起死亡率不再增加;空白对照受试鹌鹑生长正常,未出现死亡情况。由表1可知,血根碱对日本鹌鹑急性经口毒性7 d-LD50=556 mg/kg体重,95%置信限=435～712 mg/kg体重。按照《GB/T 3170.9-2004化学农药环境安全评价试验准则》中农药对鸟类的急性经口毒性划分等级,属“低毒”级(7 d的LD50>500 mg/kg体重)。

表1 血根碱对日本鹌鹑急性经口毒性Table 1 Toxicity of sanguinarine to Coturnix japonica

2.2 血根碱对家蚕的毒性

家蚕对药剂处理后桑叶取食正常,说明血根碱无拒食作用;中毒后表现为体缩、晃头,扭曲,侧倒。连续观察96 h,结果表明,家蚕死亡率与给药质量浓度、取食染毒桑叶时间呈正相关,自给药后死亡率随时间增加;空白对照受试家蚕取食生长正常,未出现死亡情况。由表2可知,血根碱对家蚕急性毒性96 h的LC50=680 mg/L,95%置信限=514～975 mg/L。按照《GB/T 3170.11-2004化学农药环境安全评价试验准则》中农药对家蚕的急性毒性划分等级,属“低毒”级(96 h的LC50>200 mg/L)。

表2 血根碱对3种非靶标生物的急性毒性Table 2 Acute toxicity of sanguinarine to three non-target organisms

2.3 血根碱对斑马鱼的毒性

鱼苗投入药液后,0.5、0.6、0.72 mg/L 处理组试验鱼集群游动,0.865、1.04 mg/L 处理组试验鱼游动缓慢,并出现侧游、沉底现象。连续观察至96 h,5个处理浓度均出现试验鱼游动缓慢、侧游和死亡症状,空白对照试验鱼活动正常,未出现死亡情况。由表2可知,血根碱对斑马鱼急性毒性96 h-LC50=0.64 mg/L,95% 置信限=0.49～0.74 mg/L,按照《GB/T 3170.12-2004化学农药环境安全评价试验准则》中农药对鱼类的急性毒性划分等级,属“高毒”级(0.100 mg/L

2.4 血根碱对大型溞的毒性

大型溞中毒症状表现为活动缓慢,连续观察48 h,5个处理浓度均存在活动受抑制的大型溞,空白对照大型溞活动正常。由表2可知,血根碱对大型溞急性运动抑制毒性48 h-EC50=0.34 mg/L,95%置信限=0.26～0.45 mg/L。按照《GB/T 3170-132004化学农药环境安全评价试验准则》中农药对大型溞的急性运动抑制毒性划分等级,属“高毒”级(0.100 mg/L

2.5 血根碱对斜生栅藻的毒性

在试验结束时,对照组、药液浓度在240 μg/L及以下的各处理组为肉眼可见的绿色,其中对照组颜色最深;药液浓度为480μg/L的处理组仍为无色,显微镜下观察,可见部分藻细胞体积膨胀、细胞核轮廓模糊、细胞碎片。以实测血根碱处理浓度对数为横坐标、药后72 h生长率和生物量抑制率为纵坐标,由表3可知,得血根碱对斜生栅列藻抑制毒性72 h-ErC50=285μg/L,95%置信限=225～359μg/L;72 h-EyC50=61.1μg/L,95%置信限=50.1～74.7μg/L。按照《GB/T 3170.14-2004化学农药环境安全评价试验准则》中农药对藻类毒性划分等级,属“高毒”级(EC50≤300μg/L)。

表3 血根碱对斜生栅列藻的急性毒性Table 3 Acute toxicity of sanguinarine to S.obliquus

2.6 血根碱对蜜蜂的毒性

蜜蜂中毒症状为爬行缓慢、精神萎靡不振、围绕打转,死亡时双翅展开、喙伸出、腹部向前勾。连续观察48 h,结果表明,试验中蜜蜂死亡率与接触、取食血根碱剂量、时长呈正相关,死亡率逐渐增加;空白、丙酮对照受试蜜蜂活动正常,未出现死亡情况。由表4可知,得血根碱对蜜蜂急性接触48 h-LD50=37.7 μg/蜂,95%置信限=24.8～73.2μg/蜂;血根碱对蜜蜂急性经口48 h-LD50=46.2μg/蜂,95%置信限=31.5～82.7 μg/蜂。按照《GB/T 3170.10-2004 化学农药环境安全评价试验准则》中农药对蜜蜂的急性毒性划分等级,均属“低毒”级(48 h-LD50>11.0 μg/蜂)。

表4 血根碱对蜜蜂的急性毒性Table 4 Toxicity of sanguinarine to Apis mellifera

3 结论与讨论

本研究测定血根碱对6种环境非靶标生物的安全性,明确血根碱对环境有益生物蜜蜂、鸟类、家蚕低毒,对鱼类、溞类、藻类的毒性高毒,具有一定的风险性,这对血根碱后续田间应用提供了数据支撑。

因为源自天然,传统观念认为植物源农药低毒、对非靶标生物安全,但植物源农药并非对所有的非靶标生物都具有生物合理性,因其自身特性,有些对特定非靶标生物毒性并不低,如印楝素对鸟类高毒、鱼藤酮对鱼类剧毒、除虫菊素对鱼类高毒、蝥素乳对蝌蚪中毒[14-16]。血根碱是从多年生草本植物博落回中提取分离得到的异喹啉类生物碱,具有较好的杀虫、杀菌活性[5-6]。目前,农药领域对血根碱的研究多集中在生物活性、作用机理、哺乳动物毒性等方面[7-8],其对非靶标生物的毒性尚鲜见报道。本研究中血根碱对斑马鱼、大型溞、斜生栅列藻均表现为高毒,表明其产品开发应以旱田作物有害生物防治为主,相关农药产品使用时应尽量远离水产养殖区、河塘等水体附近施药,禁止在河塘等水体中清洗施药器具,以降低其对水生环境非靶标生物的影响。此外,国家近年来不断加强对植物源农药登记的环境有益生物安全评价政策要求,科研院所、农药企业在开发植物源农药产品时,应充分考虑这一因素,以免最后登记受阻。同时,随着农药减量增效技术的推广,大量生物源农药替代化学农药得到应用,但使用者对生物源农药对有益生物的影响关注较少,对环境造成潜在威胁[14]。因此开展植物源农药对非靶标生物的安全性评价具有重要意义。