以层次分析及多指标正交法优选丁半颗粒提取工艺*

傅静娟，邹恺平，倪文澎，王 迅，吴旭彤

南京中医药大学附属医院&江苏省中医院，南京 210000

丁半颗粒由紫花地丁[1]和半边莲[2]两味中药组成，由江苏省中医院院内制剂丁半合剂改良而来，目的为使患者服用方便并改进其口感。原制剂丁半合剂具有清热解毒功效，临床用于一般感染和毒蛇咬伤，疗效显著。处方中重用紫花地丁为君药，以清热解毒，凉血消肿；辅以半边莲为臣药，清热解毒，利水消肿；共奏清热解毒消肿之功。

为了保证临床疗效，本研究以浸膏得率、总黄酮含量、秦皮乙素[3，4]含量作为综合评价指标，采用层次分析法[5]，根据处方中各药材的作用计算各评价指标的权重系数，进行多指标性成分综合评价，以综合评分进行正交试验分析，对溶剂用量、提取时间、提取次数进行考察，优选最佳提取工艺。

1 仪器与药品、试剂

Agilent 1260 高效液相色谱仪，四元泵（G1311A）；BP-211D 十万分之一电子分析天平（德国Sartorius）；AX224ZH/E 万分之一电子天平（美国OHAUS Corp）；Cary 50 Conc 紫外可见分光光度计（美国Varian）。

紫花地丁（批号：20180701）、半边莲（批号：20181101）为安徽井泉中药饮片有限公司产品，均经过本院主任中药师吴旭彤鉴别及薄层色谱验证；秦皮乙素对照品（南京聚康医药化工有限公司，批号180929）；芦丁对照品（南京聚康医药化工有限公司，批号181024）；硅胶G 板（青岛海洋化工厂分厂）；试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

所用药材饮片为紫花地丁和半边莲，按文献[6]方法操作甄鉴。

2.2 总黄酮的测定

以芦丁为对照品溶液，测定其吸光度，绘制总黄酮标准曲线，为Y=9.732 1X+0.013 9，r2=0.993 5。

2.3 单因素考察[7]

2.3.1 加水量在其他煎煮条件不变的情况下，考察溶剂为8、12、20 倍量的煎液中浸膏得率和总黄酮含量（一剂处方量）。结果见图1。

图1 提取溶剂用量对浸膏得率（A）及总黄酮含量（B）的影响

从图1 可知，在药材条件不变情况下，对丁半颗粒浸膏得率和总黄酮含量的影响来看，当溶剂用量为20 倍时，浸膏得率与总黄酮含量均最高。

2.3.2 提取时间在其他煎煮条件不变的情况下，考察提取时间为30、60、120 min 的煎液中浸膏得率和总黄酮含量。结果见图2。

从图2 可知，提取时间越长，浸膏得率含量越高；当提取时间为60 min 时，总黄酮含量最高，而提取时间为120 min 时总黄酮含量变低。

图2 提取时间对浸膏得率（A）及总黄酮含量（B）的影响

2.3.3 浸泡时间分别考察浸泡30、60、90min 药材的吸水率。结果见图3。

图3 浸泡时间对吸水率的影响

从图3 可知，60 min 之前，浸泡时间越长，吸水率高；此后，吸水率基本不变，因此确定浸泡时间为60 min。

2.4 提取工艺优选

用层次分析法计算权重，根据复方活性成分的药理作用强弱和君臣佐使的配伍规律，将秦皮乙素含量、总黄酮含量和浸膏得率作为权重指标[5，7]。因药材均含总黄酮成分，且起到抗菌、抗病毒作用[1-4]，故总黄酮权重系数最高；秦皮乙素含量稍低，具有抗菌作用[2]，故权重系数次之；而浸膏中杂质含量较多，故权重系数最低。从主观上将其比较列为总黄酮＞秦皮乙素＞浸膏得率，参考相关文献，根据表1各层次评分标准，建立层次结构模型，见图4，并构成两两比较矩阵，见表2。

图4 层次结构模型

表1 各层次评分标准

根据表2 中判断的结果对数据进行归一化处理，计算浸膏得率、总黄酮、秦皮乙素所得权重系数分别为0.2937、0.4230、0.2833。一致性比例因子CR=0.040 9＜0.10，表明此判断矩阵满足一致性要求，权重系数有效[8]。

表2 指标成分对比判断优选矩阵

2.4.1 正交试验设计根据对单因素考察结果的分析，最终选择浸膏得率、总黄酮含量、秦皮乙素含量作为正交试验考察指标，以提取时间，溶剂用量及提取次数为试验因素，设计L9（34）正交试验，筛选丁半颗粒水提取最优工艺条件。因素与水平见表3。9 组提取液均通过旋转蒸发仪减压浓缩至每毫升浓缩提取液相当于1 g 饮片量。

表3 正交试验因素水平表

2.4.2 正交试验由表4、表5 可知，正交试验考察因素对综合评分的影响顺序为B>C>A，根据方差分析结果，因素B 受到显著影响，而A 和C 对结果的影响没有显著性差异。从直观分析和方差分析，最佳工艺条件为A3B3C2；但结合生产实际，最终选择工艺A1B2C1为丁半颗粒的提取工艺，即加水量为15倍，提取2 次，每次提取0.5 h。

表4 正交试验结果

表5 正交试验方差分析

2.4.3 工艺验证试验按处方量称取紫花地丁和半边莲药材，平行3 份，采用最佳提取工艺煎煮提取，即用15 倍量的水回流提取2 次，每次提取0.5 h；合并滤液，浓缩至500 mL，灭菌。测定浸膏得率、总黄酮含量，秦皮乙素含量。见表6。

表6 工艺验证试验结果

3 讨论

本实验根据处方中原药材的性质和实际生产情况分析，最终采用水提取方法。以紫花地丁中秦皮乙素含量，提取液中总黄酮的含量和浸膏得率为考察指标进行综合评价，确定最佳水提工艺为将药材先浸泡1 h，用15 倍量的水回流提取0.5 h，提取2 次。

在秦皮乙素含量测定中，对溶剂选择进行了考察，即比较了50%、100%甲醇以及50%、100%乙醇等4 种溶剂对色谱峰的影响，结果显示，100%甲醇提取效率高，峰形好。还对流动相比例进行多次试验调整，最终确定流动相为0.1%磷酸水-甲醇（70∶30），秦皮乙素峰形较好，方法简单可行，且流动相配制简洁。

基于层次分析法的正交试验设计：以往对中药处方分析提取效果的优劣常以主观评价为主；随着检测水平的逐渐提升，越来越多的指标性成分能够实现同步测定。根据中药多成分、多靶点、多层次的特点，对多指标做出合理的综合评价是最终确立提取工艺的关键，可使实验结果更加准确。