浦江葡萄同位素与矿物元素特征及地理标志保护模型构建

申 雪 袁玉伟 聂 晶 李春霖 邵圣枝 佘俊艳 武 运,* 张永志,*

(1 新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2 浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所， 浙江 杭州 310021；3 农业农村部农产品信息溯源重点实验室，浙江 杭州 310021)

浦江县位于浙江省金华市北部，属亚热带季风气候，全年气候温和，光照充足，独特的盆地气候适合葡萄的生长[1-2]。近年来，随着浦江葡萄产业迅速发展，种植面积已达4 467公顷，成为浦江农业的第一大产业，也是农民增收的支柱产业之一。2013年浦江县被授予“中国巨峰葡萄之乡”称号，当地政府也将“浦江葡萄”注册为农产品地理标志产品[3-4]。随着长江三角洲地区农产品物流网络的构建[5]，浦江葡萄也受到各地消费者的青睐。农产品的品质与种植环境息息相关，为保护浦江葡萄的健康发展，建立一种“浦江葡萄”的产地溯源与鉴别方法十分必要。

稳定同位素的组成与环境因子(温度、湿度、降水量)、地理环境(经度、纬度、海拔)等密切相关，而矿物质元素含量可以反映土壤类型，因此将稳定同位素与矿物质元素相结合可以更有效地反映农产品产地信息。目前，该技术已在葡萄酒[6-9]、谷物[10-13]、肉制品[14-15]、茶叶[16-17]等产品追踪溯源地的应用中取得良好成效。如，Wang等[18]发现将稳定同位素与矿物元素相结合以及适当使用化学计量法可将不同农场中的香蕉进行有效区分；陈历水等[19]发现黑加仑果实中碳和氮稳定同位素是产地溯源的有效指标；李安等[20]利用稳定同位素比值与稀土元素含量结合可对不同产地的大桃进行有效判别。大量研究表明，稳定同位素与矿物元素相结合可对不同国家或不同省份地理尺度较大的农产品进行有效的产地溯源[21-22]，而小尺度地理范围(同一区域)的判别方法有待考证[23]。因此，对小尺度葡萄中稳定同位素和矿物元素的差异进行分析，可为进一步完善产地溯源提供理论基础。

为研究浦江与长江三角洲其他产地葡萄中稳定同位素与矿物质元素含量分布特征，本试验采用稳定同位素比率质谱(elemental analyzer-stable isotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS)和电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)测定了浦江、安徽合肥、上海市嘉定区与浙江其他产地(慈溪、温岭)的葡萄样品，分析相关同位素和矿物元素含量与产地特征及影响因素，建立长江三角洲区域小尺度下的浦江葡萄产地溯源模型，以期为尺度更小的农产品产地判别和地理标志产品保护提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验共采集119份巨峰葡萄样品，分别来自上海市、安徽省合肥市、浙江省金华市浦江县与其他县市(慈溪市、温岭市)。每个产地选取2～3个葡萄园，在葡萄园中采取对角线取样，每个采样点采集2～3 kg。样品产地信息如表1所示。

表1 葡萄样品数量及原产地Table 1 The amounts of grape samples and their origin

稳定同位素标准物质IAEA-CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB=-10.45‰)、IAEA-N-2(硫酸铵，δ15Nair=20.30‰)，均购自奥地利国际原子能机构; B2155(δ13CV-PDB=-26.98‰,δ15Nair=5.94‰)、USGS64(δ13CV-PDB=-40.81‰)、USGS40(δ15Nair=9.52‰)、USGS55(δ2HV-SMOW=-28.20‰，δ18OV-SMOW=19.12‰)、USGS56(δ2HV-SMOW=-44.00‰，δ18OV-SMOW=27.23‰)购自英国Elemental Microanalysis公司。矿物元素测定所用标准物质(铑和铼)均购自北京国家有色金属及电子材料分析测试中心。

1.2 主要仪器与设备

XP6型天平，瑞士Mettler-Toledo公司； Vario PYRO cube 型元素分析仪，德国Elementar公司；Isoprime100型稳定同位素比率质谱仪，英国Isoprime公司；X-seriesⅡ型电感耦合等离子体质谱仪，美国 Thermo Fisher 公司；Mars 5型微波消解仪，美国CEM公司；HR2864 粉碎机，中国飞利浦；SCIENTZ-18N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；BHW-09A24S赶酸仪，上海博通讯化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理 样品采集后，去除果梗，并用洁净的干纱布擦去果皮表面的灰尘和土壤后进行匀浆，匀浆后将样本平均分为2份，装入50 mL离心管，每份25 mL。其中一份样品置于-80℃条件下冷冻干燥4～5 d，取出后用液氮研磨成粉末装入样品袋，用于EA-IRMS检测；另一份样品直接用于ICP-MS检测。

1.3.2 稳定同位素比值测定 C和N同位素：称取约6～7 mg待测样品，放入锡箔杯(5 mm×9 mm)中包好，按编号将包好的样品放入元素分析仪的固体样品自动进样盘中。样品中C、N元素通过高温燃烧后经氧化铜还原成CO2和N2，再进入稳定同位素比率质谱仪进行检测。检测条件：元素分析仪燃烧炉和氧化炉的温度分别为1 150和850℃，载气为氦气，流量为250 mL·min-1。 在分析过程中以IAEA-CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB=-10.45‰)、IAEA-N-2(硫酸铵，δ15Nair=20.30‰)、B2155(δ13CV-PDB=-26.98‰,δ15Nair=5.94‰)、USGS64(δ13CV-PDB=-40.81‰)、USGS40(δ15Nair=9.52‰)为标准物质进行三点校正。

H和O同位素：称取约0.5 mg待测样品，放入银舟(8 mm×5 mm)中包样，包好的样品按编号放入元素分析仪自动固体进样盘中，样品中的H、O元素在经高温裂解后分别转化为 H2和CO，进入稳定同位素比率质谱仪进行检测。检测条件：元素分析仪裂解炉温度为1 450℃，氦气流量为150 mL·min-1。在分析过程中以USGS55(δ2HV-SMOW=-28.20‰，δ18OV-SMOW=19.12‰)、USGS56(δ2HV-SMOW=-44.00‰，δ18OV-SMOW=27.23‰)作为标样进行两点校正。

参照下列公式计算稳定性同位素比率值：

式中，R样品为所测样品中重同位素与轻同位素的丰度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R标准为国际标准样品中重同位素与轻同位素的丰度比，其中，δ13C以维也纳美洲拟箭石(V-PDB)为基准, δ15N以大气中氮气为基准, δ2H和δ18O以维也纳标准平均海洋水(V-SMOW)为基准。

1.3.3 矿物质元素含量及同位素比率测定 葡萄中矿物元素含量参照GB 5009.268-2016[24]测定。准确称取匀浆后的样品0.5 g放置于微波消解罐内，加入6.0 mL 65%的HNO3加盖，浸泡过夜。然后加入2 mL 30%的H2O2溶液，室温下放置20～25 min，拧上盖子，放入微波消解仪中进行消解，程序如表2所示。待消解完成后取出，冷却至室温，然后将消解内罐放置于赶酸仪中进行赶酸，至消解仪体积约0.5 mL，将赶酸后的消解液转移至50 mL容量瓶中，用去离子水定容，待测。多元素含量测定时用铑和铼作为内标溶液(25.00 μg·L-1)，监控并校正仪器漂移，方法的回收率控制在90%～110%之间，采用碰撞池技术(CCT)模式进行测定，电感耦合等离子体质谱仪具体参数见表3。

表2 微波消解参数Table 2 Optimal procedure of microwave digestion

表3 电感耦合等离子体质谱仪工作参数Table 3 Optimal procedure of Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy

1.4 数据处理及模型建立

采用单因素方差分析和最小偏二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)对葡萄原产地进行判别。数据分析前先利用Excel 2019将原始数据进行min-max标准化，然后采用SPSS 18.0 (美国IBM公司)软件对数据进行单因素方差分析(one way-ANOVA)。

将4个产地的119份葡萄样品按数量比2∶1随机分为训练集(79个)和测试集(40个)，并保证训练集和测试集中不同产地的样品数量比保持一致。将所有样品的4个稳定同位素比值(δ)与22个矿物质元素含量或同位素比率，共26个变量作为输入变量，利(soft independent modelinGClass analogy)SIMCA-p13.0软件(Umetrics，德国 Sartorius 公司)建立PLS-DA产地判别模型。

2 结果与分析

2.1 浦江与其他产地葡萄稳定同位素比率特征

由表4可知，不同产地的葡萄稳定同位素的分布呈现出一定的地域差异。4个不同产地葡萄的δ13C在-26.6‰～-25.6‰之间，符合C3植物中δ13C值的测量范围[25]。浦江除与安徽产地葡萄的δ13C具有显著差异外(P<0.05)，与其他产地葡萄的δ13C均无显著差异。植物中δ15N值与产地的土壤状况、施氮肥方式和种类相关，4个不同产地葡萄的δ15N在2.7‰～6.7‰范围内，其中浦江葡萄δ15N均值为4.2‰，略高于浙江其他(慈溪、温岭)产地，略低于安徽产地，并显著低于上海产地(P<0.05)，说明浦江葡萄中的δ13C值与δ15N值与上海和安徽葡萄有分离趋势。葡萄的水源主要来自大气降水与地下水，4个不同产地葡萄的δ2H在-38.9‰～-30.2‰范围内，浦江葡萄δ2H均值为-35.0‰，除与上海和安徽产地葡萄无显著性差异外，与浙江其他产地(慈溪、温岭)葡萄呈现显著性差异(P<0.05)，说明浦江葡萄δ2H值与浙江其他产地(慈溪、温岭)葡萄有明显分离趋势。4个不同产地δ18O值范围在24.5‰～26.9‰之间，浦江葡萄δ18O均值为24.5‰，与上海和浙江其他产地(慈溪、温岭)葡萄中δ18O值变化不大，与安徽葡萄呈显著性差异(P<0.05)，说明浦江葡萄中δ18O值与安徽葡萄δ18O值有分离的趋势。

表4 不同产地葡萄样品的稳定同位素比率Table 4 The stable isotope ratios of grape samples from different origins

2.2 浦江与其他产地葡萄矿物元素特征

参照WS/T 476-2015营养名词术语[26]将葡萄中矿物元素分为常量元素(Al、Fe、Na、P、Ca、Mg、K)与微量元素(Mn、Cu、Zn、Rb、Sr、Ba、Ga、Mo、Cd、Co、Cs、Ni、V)。此外，2个Pb同位素比(206Pb/207Pb、208Pb/206Pb)在各地的均值为0.99～1.01。由表5可知，浦江产地葡萄的常量矿物元素中P、Ca、Mg、K含量显著高于其他产地，平均范围为95～2 830 mg·kg-1；而Al元素含量略低于安徽产地的葡萄，均值为0.90 mg·kg-1，与上海葡萄具有显著差异，Na元素含量均值为11.14 mg·kg-1，显著低于浙江其他产区的葡萄。浦江产地葡萄的微量矿物元素中Mn、Rb、Ba、Ga、Co、Cs元素含量均低于2.25 mg·kg-1，Cd、Ni显著高于其他产地，而Mo元素略高于安徽产地葡萄，含量均值为0.018 mg·kg-1，与上海葡萄呈显著差异，V元素含量均值为0.001 6 mg·kg-1，与上海和安徽葡萄呈显著性差异。葡萄中的206Pb/207Pb、208Pb/206Pb主要与种植土壤的元素有关，浦江产地葡萄中206Pb/207Pb、208Pb/206Pb均显著低于安徽产地。综上，浦江产地葡萄中的大多数矿物质元素与其他产地葡萄具有显著性差异，但有Al、Na、Mo、V、Sr、Cd、Ni、Cu、Zn、Rb、Fe、Ga、Co、Cs、Ca 15个元素与一两个产地不存在显著差异，可能是因为采集同一地域的样品来源范围较广，致使样品离散度较大。

2.3 产地判别模型建立及预测

由表6可知，通过PLS-DA建立的产地判别模型训练集整体判别准确率达到82.9%，其中浦江葡萄判别效果最佳准确率为97.5%，仅有1个样品误判为浙江其他产地，浙江其他产地(慈溪、温岭)葡萄判别准确率为95.0%，有1个样品误判为浦江，安徽葡萄判别准确率为88.9%，有1个样品误判为浙江其他产地(慈溪、温岭)，上海葡萄的误判率较高，其中有2个样品误判为浦江，有1个样品误判为浙江其他产地(慈溪、温岭)，还有2个样品误判为安徽。

将测试集的40个样品作为外部验证的准确率为75.0%，其中浦江葡萄的判别准确率达到100%。浙江其他产地(慈溪、温岭)葡萄仅有1个样品误判为浦江，判别正确率为90%；上海葡萄判别准确率为60%，有2个样品被误判为其他产地，其中有1个样品被误判为浦江，有1个样品被误判为浙江其他产地(慈溪、温岭)；安徽葡萄的误判率较高，有3个样品被误判为其他产地，其中有1个误判为浦江，有2个误判为浙江其他产地(慈溪、温岭)。综上所述，此模型可对浦江葡萄进行有效的产地判别。

PLS-DA模型的训练集和测试集样品得分图如图1-A所示，训练集中R2X(cum)为 0.423,R2Y(cum)为0.368；训练集样品的分类效果明显优于测试集，均表现为浦江产地葡萄和浙江其他产地葡萄分布较集中，上海和安徽葡萄样品分布较为分散并有部分交叉现象。由图1-A可知，浙江其他产地(慈溪、温岭)的葡萄样品均分布在第三象限，上海和安徽葡萄样品均分布在第二象限，浦江葡萄样品均分布在第一、第四象限，且第一潜变量的绝对值大于其他产区，能够更好地将浦江葡萄与其他产地葡萄进行有效识别。

表5 不同产地葡萄样品矿物元素含量或同位素比值Table 5 Mineral elemenTContent or isotope ratio of grape samples from different origin

表6 PLS-DA模型判别分析结果Table 6 Discriminant analysis results model of PLS-DA

由图1-B可知，在第一潜变量中，Ga元素的绝对值最大，Cu元素的绝对值最小，均分布在第一象限；上海与安徽产地葡萄样品均分布在第二象限，其中V元素和Al元素距离上海和安徽较近，与浦江和浙江其他产地(慈溪、温岭)距离较远；浦江产地葡萄样品均分布在第四象限，其中K元素距离浦江较近，与其他产地距离较远；在第二潜变量中，4个稳定同位素相对于矿物元素而言绝对值更大，对于样品在第二潜变量的区分作用也更为明显。其中，δ13C与δ15N相隔距离较近，而δ2H与δ18O在第二潜变量呈负相关，δ2H与浦江，浙江其他产地(慈溪县、温岭市)、上海、安徽均距离较远，因此，δ2H对此判别模型的贡献率大。

注：A:训练集、测试集得分图；B: 训练集载荷图。Note: A：Score plot of training set and test set. B：Load diagram of training set.图1 PLS-DA分析图Fig.1 Analysis diagram of PLS-DA

3 讨论

本研究结果表明，浦江产地葡萄中的δ13C、δ2H和δ18O与安徽产地葡萄呈显著差异，上海产地葡萄与其他产地葡萄呈现显著性差异；葡萄属于典型的C3植物，植物中的δ13C值除与光合循环类型有关外，还与植物的种属、生长环境(如温度)、所处的纬度及部位有关[27-29]。研究表明，不同产地葡萄中的δ13C值受全年降水量与温度影响，高湿高温地区种植的葡萄中δ13C值远高于干燥、寒冷地区[30]。本研究发现浦江葡萄与安徽葡萄呈显著性差异，可能与纬度、温度、降水量等因素有关。植物的δ15N值不仅与气候环境因子(土壤水分、pH值、土壤氮营养状况和土壤δ15N值)相关，还与该地区农业肥有关[31]。Yuan等[32]通过盆栽试验发现添加不同施肥处理对油菜或土壤中δ15N值均有影响，此外，分别使用鸡粪和化肥处理过的油菜中δ15N值存在显著性差异(P<0.05)，且在同样的施肥量下油菜与土壤中的δ15N值差异不显著。说明肥料种类对δ15N值的影响大于肥料用量。本研究中虽然各产地葡萄中δ15N差异未达到显著水平，但均低于7‰，由于人工合成化学肥料的δ15N相对比较贫化，因此本试验样品中所使用的肥料为化肥的可能性较大。δ2H、δ18O不仅是水的组成元素，还是参与自然界各种化学反应和地质作用的重要物质成分[33]。对于葡萄来说，灌溉水可能与当地的降水有很大不同[34]。Camin等[35]强调δ18O与气候和地理位置的关系最强，主导变量为纬度，呈负相关；降水量和温度的δ18O和δ2H均呈正相关。本研究结果表明，浦江葡萄中δ2H、δ18O与安徽葡萄呈显著性差异(P<0.05)，这可能是由于浦江比安徽地区的纬度低、降水量相对较多和温度较高等因素有关。葡萄中含有丰富的矿物质元素，这些矿物质元素主要从种植土壤中获得，葡萄对土壤中矿物质元素的吸收还会随着品种而变化。本研究发现，浦江葡萄中P、Ca、Mg、K矿物元素含量显著高于其他产地。柴有忠等[36]通过对浦江县种植葡萄的土壤进行检测，发现浦江县各葡萄园中的土壤酸化严重。然而，弱酸性土壤中重金属元素的生物有效性高于弱碱性土壤[37]。

本研究通过测量4个稳定同位素比值和22种矿物元素含量以及同位素比共计26个变量，再结合PLS-DA建立了4个产地葡萄的判别模型。其中浦江葡萄的准确率为100%，总体判别准确率达到75%。由此可见，该方法和模型可对浦江葡萄地理标志产品进行有效判别，且为保护尺度范围较小的地理标志产品提供了参考。同时，为更好对小尺度的果品进行准确的区分，建议结合不同的种植方式、季节或测量方法，如电感耦合等离子体发射光谱仪(inductively coupied plasma optical emission spectrometer,ICP-OES)、电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等进行特征分析，构建出更加稳定和有效的产地判别模型。

4 结论

本研究结果表明，浦江葡萄与其他产地葡萄中δ15N值差异较小，δ2H和δ18O值表现出明显的纬度效应，且葡萄中δ13C值与安徽葡萄呈显著差异；浦江葡萄中P、Ca、Mg、K、Mn等矿物元素含量显著高于其他产地，利用PLS-DA判别模型对浦江葡萄与其他产地葡萄进行判别分析，所建立的判别模型对浦江葡萄的判别准确率为100%，总体判别率达到75%。因此，利用稳定同位素比值和矿物质元素含量的检测并结合PLS-DA法可以对浦江葡萄进行有效地产地判别，并且判别率较高，是产地溯源的有效方法。