响应面法优化刺五加果酒的酿造工艺

贾金辉，柴虹宇，程贵兰，蔡智军，张海涛，田晓玲，梁文珍

（辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009）

刺五加主要于分布东北、华北等地区，尤其在东北山区及半山区储量丰富，其根茎和根为名贵中药材，又称五加参[1-2]。刺五加的叶和果实既可以食用也可以药用，刺五加果营养丰富，其果实含有人体全部的必需氨基酸和Fe、Se等多种微量元素以及蔗糖、果糖、多糖等可发酵性糖，其中刺五加果实中的多糖和根茎的多糖类似，具有提高免疫力的功能[3]；同时刺五加果具有镇定安神以及抗疲劳的作用，能够缓解乏力、健忘、心悸等症状[4-6]。由于刺五加野生资源丰富，且耐寒、耐贫瘠，种植简单易行，推广刺五加的种植，能在一定程度上提高山区农民的收入[7-9]。

目前刺五加资源的利用主要是在刺五加根茎的提取入药方面，而刺五加果的利用方面研究较少[10]。刺五加果含有蔗糖等可发酵性糖、丰富的果香、较高的出汁率以及氮源，能够酿制果酒[11-13]。酿造刺五加果酒可以充分利用营养丰富的刺五加果实，增加刺五加的附加值，对刺五加果的深加工和野生资源的多方面利用具有重要意义。本文以刺五加果为原料，研究酿造刺五加果酒，以酒精度和感官评分为评价指标，进行料水比、果胶酶添加量、发酵温度和接种量4个单因素试验，在确定发酵温度的基础上，进行其他3个因素的响应面优化试验，确定刺五加果酒的最佳酿造工艺，为刺五加果酒开发和产业化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺五加（新鲜）：市售；酿酒酵母、果胶酶（10000U/mL）、焦亚硫酸钾（食品级）：意大利英纳帝斯公司；白砂糖（食品级）：中粮糖业辽宁有限公司。

1.2 仪器与设备

RHB-02手持糖度计：上海奋业光电仪器有限公司；JH-03S电子称、JH120-3电子天平：北京京衡伟业科技有限公司；HH-M4恒温水浴锅：上海赫田科学仪器有限公司；JCP-5除梗破碎机：新乡市领先轻工机械有限公司；BIOQ-6009MINIQ生物发酵罐：汇和堂生物工程设备（上海）有限公司；JLM-02膜过滤机：烟台帝伯仕自酿有限公司；GDP12-9灌装机：青州市鹏程包装机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 刺五加果酒酿造工艺流程

刺五加鲜果→分选→清洗→除梗破碎→加水→加果胶酶→加硫→调糖→浸渍→接种酵母→酒精发酵→过滤→灌装→刺五加果酒。

1.3.2 操作要点

刺五加果预处理：除去腐烂发霉的刺五加果，清洗选好的刺五加果实，洗净控水后，将其倒入除梗破碎机中，先去除刺五加果梗再将果实进行破碎，这样避免果梗中的不良物质进入果酒[14]，将得到刺五加果醪导入浸渍罐中待用。

加水：向浸渍罐中加入纯水，刺五加果与纯水的比例为3∶2（kg/L），因为刺五加果辛味比较重，添加适量的水有利于减少辛味，并保持刺五加果中营养功效[15]。

加果胶酶和硫：向刺五加果醪中加入果胶酶，操作步骤是称量果胶酶调节浓度至80 mg/L左右，然后加入20℃纯水，搅拌均匀将其溶解，加入刺五加果醪中，再进行充分搅拌，使其混合均匀。因为刺五加果中果胶物质含量较高[16]，加入适量的果胶酶有利于提高刺五加果的出汁率以及提高果酒产品的稳定性[17]。加入果胶酶12 h后向刺五加果醪中继续添加焦亚硫酸钾，操作步骤是称取80 mg/L的焦亚硫酸钾，向其中加入纯水并搅拌溶解，待没有焦亚硫酸钾颗粒即溶解充分后，倒入刺五加果醪中，搅拌均匀。添加焦亚硫酸钾的目的是杀死有害细菌并且抑制非酿酒酵母的活力，从而防止刺五加果酒染菌破败，使发酵顺利进行[18]。

调糖及浸渍：刺五加果加水稀释后，果醪的糖度随之降低，为了达到发酵所需的酒精度，需要额外添加白砂糖。加糖量计算方法为1%vol的酒精度可由18 g/L的蔗糖可转化而成，按计算结果称取白砂糖调节浓度至80g/L，并用果汁充分溶解糖，然后将溶解好的糖汁混合液导入刺五加果醪中，并进行充分的搅拌。调好糖后，果醪在浸渍罐浸渍一段时间，再启动发酵，目的是让刺五加果中的营养物质充分的浸渍出来以及让果胶酶充分的分解刺五加果中的果胶物质，克服果胶的高黏度[17，19]，确保发酵的顺利进行。具体操作为浸渍的温度20℃保持48 h。

酵母接种及酒精发酵：称取200 mg/L的酿酒酵母，将其加入适量的35℃左右的刺五加果汁中搅拌均匀，并在35℃的水浴锅中保温度25 min，待酵母升起高泡后即为活化成功，再将酵母菌液从水浴锅中冷却至室温（20℃），导入果醪中并搅拌均匀[19-20]。接种成功后，控制24℃的温度进行酒精发酵，发酵期间刺五加酒帽需压入发酵液中3次/d，并测定相对密度，当相对密度为0.995以下时说明发酵结束，大概用时8 d左右，接种量取决于发酵温度，温度越高发酵时长越短[21-22]。

过滤及灌装：发酵结束后，需要立即分离皮渣，防止皮渣下沉与酒液混合浑浊，为了获取澄清的刺五加果酒，还需要过滤处理，先将酒液经过20 μm澄清纸板进行粗滤，然后再经过0.22 μm除菌膜进行精滤，从而达到无菌的状态，最后在无菌车间进行灌装。

1.3.3 单因素试验及响应面试验

在料水比 3∶2（kg/L）、果胶酶添加量 80 mg/L、发酵温度24℃、接种量200 mg/L的初始发酵条件基础上，分别改变料水比[1∶2、1∶1、3∶2、2∶1、5∶2（kg/L）]、果胶酶添加量（40、60、80、100、120 mg/L）、发酵温度（20、22、24、26、28 ℃）、接种量（100、150、200 、250、300 mg/L），进行单因素试验，考察各个指标对刺五加果酒的酒精度及感官评价的影响。

通过单因素试验，选取显著性强的料水比（A）、果胶酶（B）和接种量（C）为考察变量，以刺五加果酒的酒精度（Y）为响应值，通过Design Expert 12软件进行三因素三水平试验，见表1。

表1 响应面优化刺五加果酒酿造工艺的因素和水平Table 1 Optimization of factors and levels in brewing process of Acanthopanax senticosus wine by response surface methodology

1.3.4 分析检测

酒精度：参考GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中酒精计法；挥发酸：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法[23]；总二氧化硫：参照GB/T 15038—2006中直接碘量法；微生物指标：参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定菌落总数[24]，参考GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定大肠菌群数[25]。

感官评判：参照GB/T 15038—2006中葡萄酒感官要求，设立20人的专家小组，建立刺五加果酒的评价体系[23]，感官评价标准见表2。

表2 刺五加果酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standard of Acanthopanax senticosus wine

1.4 数据处理

采用Excel 2007进行数据处理和制作图表，采用Design-Expert 12进行响应面试验设计和分析。

2 结果与分析

2.1 优化刺五加果酒酿造工艺的单因素试验

2.1.1 料水比对刺五加果酒品质的影响

由于刺五加果辛味比较重，添加适量的水有利于减少辛味，并保持刺五加果中营养成分的功效[15-16]，料水比对刺五加果酒的品质起着十分重要的作用。料水比对刺五加果酒品质的影响如图1所示。

图1 料水比对刺五加果酒品质的影响Fig.1 Effect of material water ratio on the quality of Acanthopanax senticosus wine

图1结果表明，随着原料比例的增加，刺五加果酒的酒精度逐步升高，原因是刺五加果实含有可发酵性糖，随着原料比例的增加，可发酵性糖也越多，产生的酒精度也越高；感官评分却随着料水比的增加呈先升高后降低的趋势，且在料水比3∶2（kg/L）时达到最高值，因为刺五加果辛味比较重，加入少量的水可以稀释这种味道，从而使感官评分增加，但过量的水会使刺五加果酒变得寡淡、颜色及营养物质降低，导致感官评分降低。

2.1.2 果胶酶对刺五加果酒品质的影响

刺五加果中果胶物质含量较高[16]，加入适量的果胶酶有利于提高刺五加果的出汁率以及提高果酒产品的稳定性[17]，如图2所示。

图2结果表明，果胶酶在40 mg/L～60 mg/L时，酒精度逐渐增高，原因是果胶酶分解刺五加果中的果胶物质，提高出汁率，从而发酵变得顺利和彻底，但果胶酶达到80 mg/L后效果不再明显；随着果胶酶的增加，感官评分先升高后降低，原因是适量的果胶酶使得刺五加果酒变得澄清及稳定，但是果胶酶超过100 mg/L后其因过量残留在刺五加果酒中，影响酒液的澄清度及口感。

图2 果胶酶对刺五加果酒品质的影响Fig.2 Effect of pectinase on the quality of Acanthopanax senticosus wine

2.1.3 发酵温度对刺五加果酒品质的影响

发酵温度对刺五加果酒的酒精产率和香气口感有重要影响，如图3所示。

图3 发酵温度对刺五加果酒品质的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of Acanthopanax senticosus wine

图3结果表明，随着发酵温度的升高，酒精度和感官评分都呈先升高后降低的趋势，且在24℃都达到最高值，原因是适宜的温度有利于酵母的繁殖和发酵。温度低于22℃，酵母启动慢，发酵迟缓，酒精产率较低，且较长的发酵时间会造成微生物侵染，导致酒体浑浊甚至破败。温度高于24℃，酵母菌的活动开始受到影响，可能引起发酵的中止，导致挥发酸含量上升、酒体质量下降。由此可知发酵温度为24℃左右为宜。

2.1.4 酵母接种量对刺五加果酒品质的影响

酵母接种量直接影响刺五加果酒的发酵进程及感官品质，如图4所示。

图4结果表明，当酵母接种量低于150 mg/L时，酒精度和感官评分都较低，可能由于接种量不足，导致发酵不完全，产酒率较低，同时由于发酵缓慢，致使刺五加果汁容易氧化、甚至受到微生物侵染，影响口感。但当接种量超过250 mg/L时，酒精度增加不再明显，同时大量的酵母菌会使刺五加果酒产生酵母味，影响香气和口感[26]。

图4 接种量对刺五加果酒品质的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on the quality of Acanthopanax senticosus wine

2.2 优化刺五加果酒酿造工艺的响应面试验

2.2.1 模型建立与方差分析

通过单因素试验，确定发酵温度为24℃最佳，选取另外三个更为显著性因素，按照表1进行优化酿造工艺的响应面试验，试验设计和结果见表3。

表3 刺五加果酒酿造工艺Box-Behnken试验设计与结果Table 3 Box Behnken experimental design and results of Acanthopanax senticosus wine technology

利用Design Expert 12软件对表3的试验数据作回归分析，以刺五加果酒的酒精度为响应值，构建刺五加果酒酿造工艺参数的回归方程：Y=11.66+0.312 5A-0.137 5B+0.1C-0.1AB-0.125AC-0.175BC-0.63A2-0.08B2-0.805C2。

对该方程进行响应面试验回归模型的方差分析，结果见表4。

表4 响应面试验回归模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表 4可知，模型呈极显著（P＜0.000 1），说明刺五加果酒的酒精度与料水比、果胶酶添加量和接种量关系显著；失拟项P值为0.090 8＞0.05，不显著，说明构建的回归模型不失拟，成功；离散系数=1.29%，说明试验的精确度高且可靠性强；刺五加果酒酿造工艺相关系数R2=0.977 2，说明该模型试验误差小，调整系数R2Adj=0.947 9，表示该模型能够解释94.79%的响应值变化；信噪比=18.218 1＞4，说明该模型很适合刺五加果酒酿造工艺试验的预测。通过显著性检验可知，一次项A和二次项A2、C2呈极显著性，一次项B和二次项BC呈显著性，其他项则呈不显著性。因为F值越大，表示该因素影响力越强，由表4可知对刺五加果酒酿造工艺影响的强弱顺序：料水比＞果胶酶添加量＞接种量。

2.2.2 响应曲面分析与讨论

对刺五加果酒的酒精度有显著影响的三个因素的响应面及等高线见图5。

图5 各因素两两交互作用对刺五加果酒酒精度影响Fig.5 The effect of pairwise interaction of various factors on the alcohol content of Acanthopanax senticosus wine

两两因素交互作用的强弱可通过等高线得出，如果等高线呈椭圆形则表明两个因素的交互作用显著，如果等高线呈圆形则表明两个因素的交互作用不显著[27]。由图5可知，接种量和果胶酶添加量两个因素的交互作用等高线趋于椭圆，故对刺五加果酒的酒精度影响显著；料水比和果胶酶添加量交互作用以及料水比和接种量的交互作用等高线趋于圆形，故对刺五加果酒感官评分影响不显著。

根据所建模型的回归方程求出最优解，得到刺五加果酒酿造工艺的最佳条件：料水比为1.656∶1（kg/L），果胶酶添加量为60 mg/L，接种量为207.336 mg/L，得到刺五加果酒的酒精度为11.802%vol。

2.2.3 最优酿造工艺验证

根据实际操作将料水比修改为1.7∶1（kg/L）、接种量修改为207 mg/L，果胶酶添加量不变仍为60 mg/L，按照此工艺参数得到实际刺五加果酒的酒精度为11.9%vol，与试验最优解的酒精度十分接近，说明为刺五加果酒酿造工艺所构建的响应面模型真实准确，有很强的参考价值[28]。

2.2.4 刺五加果酒质量指标及微生物指标

在最佳酿造工艺条件下酿造出的刺五加果酒，颜色呈红色、果香浓郁、酒体丰满、风格独特，感官评分高达94，酒精度为11.9%vol，挥发酸为0.3 g/L，总硫为42 mg/L；进行微生物指标检验得到大肠菌群＜3个，菌落总数为12个，刺五加果酒的质量指标和微生物指标均符合果酒行业标准。

3 结论

本研究通过单因素试验确定刺五加果酒酿造工艺影响显著性较强的因素，然后采用响应面分析法对其进行优化。确定最佳工艺为料水比1.7∶1（kg/L），果胶酶添加量60 mg/L，接种量207 mg/L，发酵温度24℃。得到刺五加果酒颜色呈红色、果香浓郁、酒体丰满、风格独特，酒精度为11.9%vol，感官评分为94，挥发酸为0.3 g/L，总硫为42 mg/L，进行微生物指标检验得到大肠菌群＜3个，菌落总数为12个，符合果酒行业标准。