人参皂苷Re对APP/PS转基因痴呆小鼠学习记忆力及海马Caspase-3、P53蛋白的影响

王月静 张萌 张海燕 郎尉雅 冯化杰 孙丽慧

(1齐齐哈尔医学院 1组胚教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161001；2形态学实验室)

人参皂苷是从中药材“人参”中提取出来的活性成分，人参中可分离出40多种单体。其中人参皂苷Re是人参发挥作用的关键单体之一，且含量较高。它被认为有延缓衰老和促进智力的作用〔1，2〕，学者们经过长期研究发现，人参皂苷Re能够降低阿尔茨海默病(AD)细胞内淀粉样前体蛋白(APP)及β淀粉样蛋白(Aβ)表达，改善AD的基本病变，结果表明该中药对痴呆疾病可能有防治的作用〔3〕，因此我们推测人参皂苷Re对AD动物模型中也可能有保护作用。本研究旨在探讨人参皂苷Re对AD小鼠学习记忆力及半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3与P53蛋白的影响。

1 材料和方法

1.1主要试剂 兔源Caspase-3、P53一抗及兔源二抗均购自北京博奥森生物技术有限公司，人参皂苷Re购自上海研生实业有限公司。

1.2实验动物 健康12 w龄雄性APP/PS转基因痴呆小鼠，体质量25～30 g，购自南京大学实验动物中心〔可证号 IACUC-DB-16-0602〕。动物在适应环境1 w后开始实验。实验均在标准清洁级动物实验室内完成，自由饮水。

1.3实验动物分组 50只小鼠随机分为对照组、AD组、低-Re组(人参皂苷Re：5 mg/kg)、中-Re组(人参皂苷Re：10 mg/kg)、高-Re组(人参皂苷Re：15 mg/kg)，每组10只，给药组每日灌胃1次，灌胃时间3个月，正常与AD组给予灌胃蒸馏水。

1.4Morris水迷宫 实验结束后检测各组小鼠学习记忆的能力，每天上午9点开始训练，连续训练6 d为定位航行实验，第7天为空间探索实验。

1.4.1定位航行验 将小鼠面朝池壁随机从4个象限之一放入水中，记录小鼠找到隐藏在水下平台的时间，即逃避潜伏期，如果小鼠120 s内未找到平台则引导其找到平台，并让其在平台上停留15 s。每次训练完成后记录6 d内各组小鼠逃避潜伏期。

1.4.2空间探索实验 定位航行实验结束后把平台撤去，记录小鼠穿越平台的次数、平台所在象限的滞留时间。

1.5甲苯胺蓝法检测海马组织 将石蜡切片放入60℃烤箱，60 min；脱蜡，水化，甲苯胺蓝染色后脱水，用中性树胶封片，显微镜下观察各组海马组织CA1区海马神经元变化。

1.6免疫组织化学法检测海马组织 将石蜡切片放入60℃烤箱，60 min；脱蜡，水化，抗原修复后滴加一抗，滴加二抗，继而行二氨基联苯胺(DAB)显色；复染，脱水，封片：中性树胶；采用Image Pro Plus6.0图像分析软件对海马组织Caspase-3、P53表达进行半定量分析。

1.7图像分析 用Image-Pro Plus6.0图像分析系统对免疫组化及免疫印迹结果进行图像分析。将平均光密度值计算出来。

1.8统计学分析 采用SPSS13.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1人参皂苷Re对AD模型小鼠行为学影响 将各组小鼠放入水中进行训练3 d，第4天开始记录数据记录，记录各组小鼠逃避潜伏期，共记录3 d。与对照组相比，AD组逃避潜伏期显著延长，与AD组比较，高、中、低-Re组潜伏期显著缩小(P<0.05)，其中以高剂量组最好。与对照组相比，AD组目标象限停留时间明显缩短，穿越平台次数明显减少，与AD组比较，低、中、高-Re组目标象限停留时间逐渐明显增长，穿越平台次数明显增加(P<0.05)，其中以高剂量组最高，见表1。

表1 各组逃避潜伏期、目标象限停留时间、穿越平台次数比较

2.2甲苯胺蓝染色结果 正常组海马区神经元整齐排列，神经元清晰可见的细胞合成圆形，着色较浅，所以可以清晰见到核仁，AD组海马区神经元轮廓不清，整个细胞皱缩，细胞变小，胞质染色加深，与AD组相比，低-Re组、中-Re组、高-Re组细胞体积显著变大，细胞核染色变淡，核仁可见，胞质染色变浅，见图1。

图1 各组海马区神经元形态(甲苯胺蓝染色，×200)

2.3免疫组织化学实验结果 人参皂苷Re对AD小鼠海马区神经元Caspase-3蛋白(阳性表达在胞质)与P53蛋白(阳性表达在胞核)表达的影响，对照组海马区神经元很少着色。AD组海马区神经元棕褐色阳性结果明显。与对照组比较，AD组Caspase-3、p53蛋白表达明显升高(P<0.05),与AD组比较，低、中、高-Re组Caspase-3蛋白与P53蛋白表达显著降低，呈剂量依赖性(均P<0.05)，见图2、3、表2。

图2 各组海马区神经元caspase-3蛋白免疫组织化学染色结果(×200)

图3 各组海马区神经元p53蛋白免疫组织化学染色结果(×200)

表2 各组caspase-3、p53蛋白表达比较

3 讨 论

AD临床表现为学习记忆障碍，一般患者仅有十年左右寿命，严重威胁患者的生命质量，给家人带来极大的痛苦，因此，选择有效的治疗手段迫在眉睫〔4～6〕。

本研究结果显示通过游泳训练后AD模型小鼠呈现学习记忆力显著下降，逃避潜伏期逐渐增加，最后撤掉平台后穿越平台次数减少，研究发现AD的临床综合表现与脑组织的海马区神经元损伤有关，损伤后海马区神经元结构排列紊乱细胞发生坏死甚至凋亡，从而引起认知功能障碍使其学习记忆能力显著下降。因此，本研究进行甲苯胺蓝染色和细胞凋亡实验观察海马区神经元变化，最终结果AD在发病过程中可出现多种病理改变，其中神经元发生的凋亡是发挥生理作用的关键步骤之一，AD发病过程中包括多种凋亡调节因子，如Caspase、P53、Bcl-2家族、PS等。

其中Caspase-3在机体细胞凋亡过程中发挥关键作用，它成为凋亡过程中的关键执行者，发挥效应的Caspase-3蛋白会被凋亡信号诱导，诱导后该蛋白会被激活，该分子会使细胞内靶物质降解，从而让细胞凋亡过程顺利进行。有学者发现痴呆模型动物海马组织中Caspase-3浓度升高，提示体内Caspase-3酶的活性被激活〔7，8〕；P53基因也可调控细胞凋亡，在应激状态下时(如缺血、缺氧)，机体的脑组织神经元被损伤时P53蛋白会被激活，此时该蛋白由不稳定状态变为稳定，它可诱导细胞凋亡的过程，最终它可使损伤神经元凋亡，前辈研究发现痴呆模型海马组织中P53蛋白表达升高〔9，10〕，以上研究提示Caspase-3蛋白与P53蛋白参与痴呆发病过程。

本研究结果发现，人参皂苷阿Re对AD小鼠海马区受损神经元起到保护作用，人参皂苷Re可改善痴呆小鼠学习记忆力，降低海马神经元Caspase-3、P53蛋白的表达，这与上述文献结果相似，我们推测人参皂苷Re对AD的影响机制可能为降低其受损海马神经元凋亡有关，但本文只对人参皂苷Re治疗AD疾病作用进行了初探，其具体作用机制需要更深入研究。