桃酵母双杂交cDNA文库的构建及生长素响应因子4互作蛋白的筛选

郭振华，要宏阳，杨海清，王 青 ，刁冬慧，刘悦萍*

(1.北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2.北京市平谷区人民政府果品办公室，北京101200)

桃(PrunuspersicaL.)属于蔷薇科李属植物，是世界第三大温带果树，起源于中国[1]，有着 4 000 多年的栽培历史，在中国各省区广泛栽培，资源十分丰富。北京市平谷区是中国最大的桃生产基地，桃园面积约7 000 hm2，2020年桃产量约18.33万t。桃产值收入占农民收入比重大，桃产业的发展已成为平谷区果品产业提质升级的主动力，而桃的品质是影响产业发展的关键因素。桃的形状、单果质量、果实大小和着色等外观品质以及风味、香气、糖酸比和贮运特性等内在品质决定桃的经济价值[2]，这些品质性状的形成是由环境及遗传等多种因素决定的，众多代谢相关基因及调控因子参与桃品质形成过程，通过桃基因组的深测序已挖掘出一些控制果实品质性状的基因[3]。

生长素是植物生长过程中的重要激素[4]，不仅参与植物向性生长、组织器官形成等活动[5-6]，还对果实的发育成熟起到重要的调控作用[7-9]。研究表明，内源生长素随果实成熟含量逐渐降低，果实出现软化、花青苷积累等成熟性状[10-11]。施加较高浓度的外源生长素可以延迟果实成熟，因此生长素通常被认为是果实成熟过程的负调控信号[12-15]。在溶质性桃果实中，内源生长素含量随果实成熟急剧上升。生长素通过介导其受体TIR1/AFB(Transport inhibitor response 1/Auxin signaling F-box)家族的F-box蛋白和Aux/IAA(Auxin/Indole-3-acetic acid)转录抑制因子结合， SCFTIR1/AFBE3泛素连接酶复合物将活化的泛素转移到Aux/IAA上， Aux/IAA的多泛素化导致其通过26S蛋白酶体降解，将下游的转录因子ARF(Auxin Response Factor)去抑制化，从而激活生长素信号通路，使得植物最终表现出生理反应[8]。桃优质生态安全研究课题组在桃基因组中筛选出17个ARFs编码基因，其中大部分ARF因子在桃的不同组织部位广泛存在，个别ARF因子的表达部位具有特异性，如PpARF13和PpARF16在根与茎中没有表达，PpARF5仅在果实中表达，PpARF4在桃果实成熟期的表达量呈现上升，外源生长素处理促进该基因在转录水平的表达[16]。

酵母双杂交系统能在生物体内测定蛋白的相互作用，具有较高的灵敏性，被广泛应用到蛋白互作的研究中。假阳性较高是这项技术的明显缺点[17]，目前通过改造Y2H Gold菌株可适当降低假阳性，另外采用 4 个报告基因(AUR1-C、ADE2、HIS3和MEL1)和新型稳定的抗生素AbAi，可以有效杀死非抗性克隆，从而有效降低背景克隆的生长[18]。目前酵母双杂交技术已成为检测已知蛋白之间相互作用的重要试验手段。随着科学研究的发展，更重要的是要发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白，因此需建立高质量的酵母双杂交cDNA文库(以下简称cDNA文库)用于未知蛋白的筛选。有报告通过cDNA文库，在草莓果实发育成熟研究中获得目标因子，FvMAP4K1是拟南芥AtSIK1的同源基因，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其通过细胞增殖和细胞膨大调控器官大小，长荚果变小，种子数量减少，推测其可能参与草莓的果实生长发育，通过cDNA文库筛选，获得4个可能与果实发育相关的蛋白因子[19]。在桃果实发育研究领域，PrupeSEP1在调节果实成熟软化过程中起重要作用，通过文库筛选，获得与SEP1互作的蛋白因子AKR2(Aldo-Keto Reductase，醛酮还原酶)[20]。

为研究生长素响应因子对桃果实成熟的调控机制，该试验把硬溶质桃果实成熟前后4个时期的果皮材料等量混合，利用Gateway技术构建cDNA文库，对生长素响应因子PpARF4进行文库筛选，共获得26个互作蛋白。

1 材料与方法

1.1 材 料

以硬溶质桃‘突围’为试材， 采摘于北京市平谷区中胡家务村果园，取盛花期后 75 d(第2次快速生长期，S3)、盛花期后85 d(成熟前期，S4-1)、盛花期后93 d(成熟后期，S4-2)和盛花期后101 d(完全成熟期，S4-3)的桃果实。采摘时选取长势一致，大小相似，没有明显病虫害和机械损伤的果实样品，用蘸有清水脱脂棉将未离体的果实轻轻擦拭2～3次，去除桃外果皮的桃毛。待水渍自然风干后，摘取果实，迅速分离外果皮和中果皮，将二者切成小块用锡纸包裹冻于液氮中。

1.2 方 法

1.2.1 桃果实总RNA的提取及双链cDNA的合成 收集4个时期桃的中果皮和外果皮样品，混合后液氮研磨成粉末，利用Total RNA提取总RNA，利用Oligotex mRNA Midi Kit对mRNA进行分离纯化。使用CloneMiner逆转录合成双链cDNA。将 cDNA 产物-20 ℃临时保存，于-80 ℃长期保存，用于cDNA文库的构建。

1.2.2 cDNA文库的构建及扩增 参照Clone Miner说明书合成cDNA第1链和 cDNA第2链，用104 μL的DEPC水反复吹打30～40次，溶解cDNA，获得双链cDNA，将cDNA与三框attB1重组接头连接(3种接头分别各连接1份)。对cDNA进行分级分离和收集，将双链cDNA与pDONR 222载体通过BP反应进行连接，转入大肠杆菌DH10B感受态细胞中，获得初级文库菌液。取转化后大肠杆菌原液10 μL，稀释100倍，吸取50 μL 稀释液涂布LB培养基(含Kan+)进行总库容量鉴定。随机挑取24个单克隆进行菌落PCR鉴定，对其插入片段长度和重组率进行鉴定。库容量(CFU/mL)=(培养基上的克隆数/50 μL)×稀释倍数(1×103μL)。总库容量(CFU)=库容量(CFU/mL)×文库菌液总体积(mL)。吸取1 mL次级文库菌液，加入100 mL含有Amp+的肉汤培养液中，置于30 ℃摇床， 220 r/min振荡培养过夜；将100 mL扩增的次级文库菌液，利用质粒抽提试剂盒进行抽提，予以备用。

1.2.3 cDNA文库质量与滴度检测 按照Microtube配制反应液，随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，在Thermal Cycler PCR仪上进行PCR反应，1% Agarose胶电泳鉴定。

1.2.4 pGADT7-PpARF4诱导表达载体的构建及自激活检测 通过PCR反应扩增PpARF4基因，根据该基因的功能区设计引物：上游引物PpARF4-F是cgccatatgATGGAAATTGATCTGAACC，下游引物PpARF4-R是gcgtcgacTTAGACCCTGATTACTGTTGG。利用无缝克隆连接载体pGADT7，经酶切鉴定，测序，成功构建PpARF4-pGADT7。将目的基因与pGADT7载体连接后转化到大肠杆菌后获得PpARF4-pGADT7重组质粒。将PpARF4-pGADT7重组质粒转入Y2H gold酵母感受态细胞中，在SD/-Leu-Ade-His培养基中检测PpARF4转录因子的自激活能力。

1.2.5 以PpARF4为诱饵筛选cDNA文库 采用Mating法将含有PpARF4-pGADT7重组质粒的Y2H gold酵母细胞与cDNA文库共培养，形成结合子。在含有X-α-gal的SD/-Leu -Ura-Ade-His培养基中筛选酵母菌株。然后将酵母菌株进行菌落PCR试验，选取其中的阳性克隆进行测序。

1.2.6 序列分析 在NCBI中通过Blast的方法获得基因的全长序列，最后以GDR数据库为依据对基因功能进行注释。

2 结果与分析

2.1 果实总RNA的提取及ds cDNA的合成

为建立桃果实成熟前后的cDNA文库，收集‘突围’桃的中果皮和外果皮样品，用液氮研磨成粉末，利用Total RNA试剂盒提取总RNA，利用Oligotex mRNA Midi Kit对mRNA进行分离纯化，使用CloneMiner逆转录合成双链cDNA，用于后续的建库(图1)。

注：M是marker；1是桃中果皮；2是桃外果皮。Note:M is marker; 1 is mesocarp of peach fruit; 2 is exocarp of peach fruit.图1 桃果实总RNA的提取Fig.1 RNA extraction from peach fruit

2.2 cDNA文库质量和滴度检测

首先进行BP重组，将桃的cDNA与pDONR222共转化大肠杆菌，培养后获得初级文库菌液。将初级文库菌液稀释100倍，然后取50 uL涂于LB固体培养基，培养后第2天得到初级文库总库容量1.04×106CFU(图2A)，随机选取24个克隆进行菌落PCR检测，电泳结果如图2B，片段大小差异较为明显，主要分布在1 000～2 000 bp，重组率为96%，覆盖率较高，达到初级文库要求。

注：A是初级文库总库容量鉴定；B是初级文库插入片段PCR鉴定；M是marker；1-24是挑选的克隆。Note:A is the capacity of primary library; B is PCR identification of inserted fragments in the primary library; M is Marker; 1-24 is selected colonies.图2 初级文库总库容量及插入片段PCR鉴定Fig.2 Identification of the capacity and PCR of inserted fragments in the primary library

抽提初级文库质粒，与PGADT7-DEST载体进行LR重组，转化大肠杆菌DH10B，培养后得到次级文库菌液，将菌液稀释100倍，取50 uL涂于LB固体培养基，获得总库容量1.6×107CFU(图3 A)。随机选取24个克隆进行PCR检测，主要集中在1 000～2 000 bp，重组率为100%，电泳结果如图3 B，所获结果满足次级文库要求，可进行后续cDNA文库筛选试验。

注：A是次级文库总库容量鉴定；B是次级文库插入片段PCR鉴定；M是Marker；1-24是挑选的克隆。Note:A is the capacity of secondary library; B is PCR identification of inserted fragments in the secondary library; M is marker; 1-24 is selected colonies.图3 次级文库总库容量及插入片段PCR鉴定Fig.3 Identification of the capacity and PCR of inserted fragments in the secondary library

2.3 pGBKT7-PpARF4诱饵载体的构建与自激活检测

通过PCR反应成功扩增PpARF4基因。对目的基因和pGBKADT7质粒进行连接，并转化至大肠杆菌中，通过菌落PCR筛选，再经过双酶切检验，将构建成功的pGBKT7-PpARF4重组质粒转入AH109酵母菌株中，置于SD/-Trp固体培养基上培养，然后对单菌落重悬，采用GAL4系统检测自激活，在添加X-gal试剂的SD/-Trp/-Ura-Ade/X-gal/AbAi缺陷型培养基中未长出蓝色酵母菌株，证明PpARF4诱饵蛋白不存在自激活(图4)，可进行下一步试验。

图4 pGBKT7-PpARF4诱饵蛋白自激活检测Fig.4 Self-activation assay of pGBKT7-PpARF4 bait protein

2.4 酵母双杂交筛选PpARF4的互作蛋白

将构建好的pGBKT7- PpARF4 质粒和桃果实cDNA文库质粒共转化Y2H Gold 酵母感受态细胞，稀释100倍涂布于SD/-Trp/-Leu培养基上，培养4 d长出菌落，将筛选得到的阳性克隆再次转移到SD/-Trp/-Ura-Ade/X-gal/AbAi选择性培养基上，得到48个阳性克隆(图5)，选取阳性克隆进行PCR鉴定，最终得到测序成功的阳性克隆共26个。

图5 PpARF4蛋白cDNA文库筛选获得的克隆Fig.5 Colonies obtained by PpARF4 screening in cDNA library

2.5 互作蛋白的功能注释

利用酵母质粒提取试剂盒，提取测序成功的阳性克隆的酵母质粒。将酵母质粒转入大肠杆菌，过夜培养，送公司测序。测序后得到26个蛋白，在NCBI上的信息如表1所示，获得的鉴定蛋白功能涉及植物激素信号转导相关蛋白、胁迫应答因子、物质代谢和形态建成等因子。通过该试验建立的cDNA文库，筛选获得的PpARF4互作蛋白，为进一步研究桃果实发育成熟机制提供了有价值的信息。

表1 筛选获得的PpARF4互作蛋白及其功能预测Tab.1 The proteins interacting with PpARF4 by screening and its functional prediction

3 讨 论

桃果实的发育成熟过程是由多因子调控的生理代谢过程，该试验用桃果实成熟前后果皮样品成功构建cDNA文库，通过筛选，有利于获得与果实成熟相关的目标蛋白因子。构建高质量的cDNA文库是利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白的重要保证，该试验构建的cDNA文库有较高的重组率(100%)，较长的插入片段(1 000～2 000 bp)和较大的总库容量(1.6×107CFU)，属于高质量的cDNA文库，为后续筛选与桃果实成熟相关的靶蛋白提供重要的试验体系。

转录因子ARF是响应生长素信号的关键反应因子，在桃果实上存在17个PpARFs基因[21]，在果实的成熟过程中PpARF4基因的表达量下调，是桃果实成熟过程中果皮花色苷积累的负调控因子[22]，而PpARF4调控的靶基因及其互作的蛋白因子是探究PpARF4功能的关键。该研究利用构建好的cDNA文库，成功筛选到诱饵蛋白PpARF4的26个潜在互作蛋白。其中响应逆境胁迫或植物激素信号转导相关蛋白有9个，分别是蛋白TIFY10b，E3泛素蛋白连接酶RGLG2，E3泛素连接酶PARAQUAT TOLERANCE 3，甘氨酸裂解系统H蛋白2，茎部特异性蛋白TSJT1，激发子反应蛋白3，NADH脱氢酶(泛醌)1β复合物亚单位10-B，水通道蛋白TIP1-1和组氨酸的磷酸转运蛋白1；与大分子代谢相关的蛋白7个，分别是酰基辅酶A硫酯酶13，烯醇化酶，CTP合酶，叶绿素体内的伴侣蛋白dnaJ A6，果糖-二磷酸醛缩酶3，UDP-D-木糖合酶2和延伸因子1-α；参与组织器官形成的蛋白有7个，包括patellin-3蛋白，开花基因K同源域，COP9信号体复合物亚基5a，阿拉伯半乳聚糖蛋白1，微管蛋白β链，富含甘氨酸的蛋白2和花粉特异性蛋白C13；参与蛋白合成和修饰的因子有3个，分别是40S核糖体蛋白S17、40S核糖体蛋白S3a和泛素硫酯酶OTU1。目前获得的26个互作蛋白中没有发现与桃果实花青苷代谢相关的因子，可能的原因是该试验构建的诱饵蛋白载体时选取的是PpARF4的功能区，不是完整的编码区序列，对于一些互作较弱的蛋白没有检测到。该试验发现与花青苷形成的光信号因子COP9信号体复合物亚基5a，并获得一些与糖代谢及细胞壁形成相关的蛋白，这为进一步探究PpARF4在桃果实品质形成中的可能作用提供了重要的信息。

4 结 论

建立了高质量的桃果实cDNA文库，初步筛选出与生长素响应因子PpARF4互作的蛋白26个。