咪鲜胺和咯菌腈复配剂对番茄枯萎病的防治效果及残留检测

罗 嫚 SIHOMCHANH Bounpheng 何 琼 谭辉华 李雪生 吴海燕*

（1 广西大学农学院，广西农业环境与农产品安全重点实验室，广西南宁 530004；2 国家农林研究院园艺研究所，老挝万象 7071）

番茄（）是广泛种植的蔬菜作物，具有较高的营养价值，种植面积居世界第2 位，仅次于马铃薯，且居加工蔬菜第1 位（Lal et al.，2017）。近年来，随着设施番茄的种植面积持续增加，经土壤传播的番茄枯萎病亦发生严重，成为制约番茄设施生产的瓶颈问题（禇新培 等，2020）。番茄枯萎病是由尖孢镰孢菌番茄专化型（f.sp.）侵染引起的，在番茄幼苗期到成株期均可发生（詹发强等，2013；贺宏伟 等，2018；Manikandan et al.，2018）。多年连作的地块发病率高达20%～40%，并呈逐年加重的趋势，番茄采收前期和中期发病均会出现严重的减产现象（Anitha &Rabeeth，2009；闫敏 等，2013）。

广西百色市田阳县位于中国华南地区，露地大面积冬种番茄。近年来，随着番茄生产的规模化和集约化，病害发生越来越严重，番茄枯萎病、灰霉病、细菌性斑点病等为害造成的损失逐年增加（李宝聚 等，2014；张静洁 等，2021）。其中番茄枯萎病常与根结线虫协同侵染，加重病情，是该地区的主要病害之一。生产上防治枯萎病最经济有效的方法是选育抗病品种，但抗枯萎病的番茄种质资源有限，且抗枯萎病番茄品种因产量低而未被广泛种植（Landa et al.，2004）。目前，化学防治仍是防治枯萎病的主要手段，但由于单一药剂的长期使用或不合理使用，病原菌容易产生抗药性。在草莓枯萎病菌对多菌灵和戊唑醇的抗性研究中发现，利用含上述两种药剂的培养基分别继代培养草莓枯萎病菌到45 代和36 代后，枯萎病菌对多菌灵和戊唑醇的抗药性分别增加到53.91 倍和34.22 倍；对抗性菌株的遗传稳定性测定发现，该病菌在连续转代培养8 代后抗药性稳定性较强，对多菌灵和戊唑醇的抗性能够通过无性繁殖遗传（顾春波，2010）。因此，如何降低枯萎病菌对农药的抗药性仍是生产上亟待解决的问题。前人研究表明，通过相关药剂复配可提高防病效果，延缓病原菌对单一药剂的抗药性。比如，田间使用1%申嗪霉素悬浮剂与40%咪鲜胺水乳剂复配，对小麦赤霉病的防效达84.65%，显著高于单剂防效（侯昌亮 等，2014）。本试验在前期获得的咪鲜胺和咯菌腈最佳浓度（10 mg · L）和复配比（2∶8）基础上（李丙雪 等，2021），进一步开展盆栽试验和药剂残留检测，以期为延缓枯萎病菌抗药性产生，减少用药量等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株是2018 年2 月分离于广西百色市田阳县番茄种植基地采集的番茄枯萎病病株，在广西农业环境与农产品安全重点实验室采用常规组织分离法对样本进行病原菌的分离、培养和纯化，经形态学及分子鉴定为（基因登录号为：MN240928）。供试番茄品种为改良毛粉802 F，购自广州亚蔬园艺种苗有限公司。采用的基质为全价育苗基质（有机质+腐殖酸≥50%），长春益农赛世泥炭开发有限责任公司生产。

参试药剂：96.8%咪鲜胺原药，99.2%咯菌腈原药，均为山东潍坊润丰化工有限公司生产；复配剂为咪鲜胺原药和咯菌腈原药按照2∶8（体积比）配制，其中单剂的有效成分含量均为10 mg · L，前期试验结果表明该复配剂对番茄枯萎病菌的抑菌率达91.1%（李丙雪 等，2021）。

试验仪器：GXZ 型恒温培养箱，宁波江南仪器厂生产；Sigma 3K13 离心机，德国Sigma 公司生产；Agilent 7890A 气相色谱仪，高效液相色谱串联质谱，Eclipse Plus C18 液相色谱柱（50 mm × 2.1 mm，1.8 μm），美国Agilent 公司生产。

1.2 方法

1.2.1 枯萎病防治试验 将10 g 大麦粒装入250 mL 三角瓶，共装15 瓶，加无菌蒸馏水过夜，高压蒸汽灭菌30 min，冷却后再次灭菌30 min。预先准备好PDA 平板培养7 d 的番茄枯萎病菌，用直径6 mm 的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种到大麦培养基上，置于25 ℃恒温培养箱中培养14 d。在培养过程中，每天摇动2 次以确保菌丝体在大麦种子上均匀生长。

2019 年5 月，将番茄种子播于规格为38 cm ×28 cm × 5 cm 的育苗盘中，在广西大学农学院温室中育苗；幼苗3～5 叶期移栽至装有300 g 基质的花盆（直径15 cm）中，每盆1 株。移栽5 d 后，用玻璃棒在距离番茄根茎2 cm 处打3 cm 深的孔，接种带菌大麦种子，每株幼苗接种10 g，然后用基质覆盖。接种枯萎病菌10 d 后，进行药剂处理。设置5 个处理：①96.8%咪鲜胺和99.2%咯菌腈复配剂（2∶8）；② 96.8%咪鲜胺单剂10 mg · L；③99.2%咯菌腈单剂10 mg · L；④ 清水对照；⑤以未接种枯萎病菌的植株为空白对照。采用完全随机排列，2 次重复，每重复15 盆。采用灌根的方式施药，每盆用量100 mL，未接种枯萎病菌的植株浇灌100 mL 清水。施药后定期定量浇水，常规管理。分别在施药后10、20、30、40、50 d 调查枯萎病发病情况，观察植株长势，并拍照记录。

番茄枯萎病分级标准参考马欣等（2016）的方法：0 级，健康植株，叶片无症状；1 级，1 片或2片子叶明显变黄，以致脱落；2 级，1 片或2 片真叶变黄或全株发黄，叶片萎蔫下垂；3 级：全株明显萎蔫或真叶严重变黄，植株生长受抑制、矮化；4 级：全株严重萎蔫以致枯死。

发病率=发病株数／总株数× 100%

病情指数=∑（各级病株数×相应级值）/（调查总株数×最高级值）× 100

防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数× 100%

施药后50 d，每处理分别轻取感病植株15株，采用卷尺测量株高（茎基部到主茎顶部的距离）、根长、茎部病斑长度（根部最上面发根处到病斑延伸末端之间的距离）（Ndeve &Roberts，2019）。

1.2.2 咪鲜胺残留测定 施药后50 d，每处理随机选取15 盆，用剪刀剪取茎（茎基部5 cm）、叶片，并取土样（即花盆中的基质），分别装袋、记录，置于-20 ℃冰箱中暂存。称取茎、叶片以及土壤样品各100 g，每处理3 次重复，分别用组织捣碎机粉碎。然后称取5 g 样品于研钵中，研磨后置于50 mL 离心管中，再加入2 mL 盐酸（1 mol · L）、5 mL 饱和氯化钠、40 mL 丙酮，振荡1 h 后，4 800 r · min离心10 min，取上清液转至浓缩瓶中，浓缩去除丙酮后转至分液漏斗，加入40 mL 饱和氯化钠、60 mL 去离子水，用二氯甲烷萃取2 次，每次用量20 mL，取有机相过无水硫酸钠于浓缩瓶中浓缩近干，再用5 mL 二氯甲烷冲洗一并转至20 mL具塞试管中，氮气吹干后加入5 g 吡啶盐酸盐，于220 ℃沙浴进行衍生化处理2 h，冷却后待净化。依次用20、20、10 mL 去离子水冲洗试管，将水解产物转至分液漏斗中，加入5 mL 盐酸（1 mol ·L），用石油醚萃取2 次，每次用量20 mL，取有机相过无水硫酸钠后，用20 mL 石油醚冲洗无水硫酸钠，浓缩近干，最后用正己烷定容至5 mL，待GC-μECD（气相色谱微池电子捕获检测器）检测。

咪鲜胺标准曲线的制作：咪鲜胺在环境中的降解产物有多种，但最终都会降解成对环境影响较大的2，4，6-三氯苯酚，因此用2，4，6-三氯苯酚配制成浓度为0.01、0.05、0.50、1.00、5.00 μg · mL的5 个系列标准溶液，以峰面积为纵坐标，浓度（μg ·mL）为横坐标进行线性回归分析。在最佳试验条件下检测咪鲜胺及其最终代谢产物2，4，6-三氯苯酚残留量。

1.2.3 咯菌腈残留测定 样品前处理同1.2.2。称取2.5 g 已粉碎的样品置于离心管中，土壤、茎、叶片样品中分别加入10、5、5 mL 超纯水，涡旋5 min 后，加入5 mL 乙腈，再次涡旋5 min，然后加入3 g 无水硫酸镁、2 g 氯化钠，盖上盖子混匀，继续涡旋3 min 后，4 000 r · min离心3 min，吸取1.5 mL 有机相于2 mL 离心管中，转移到上机小瓶中，备用。

仪器检测条件：高效液相色谱串联质谱，Eclipse Plus C18 液相色谱柱。操作条件：乙腈∶水=80∶20；流速：0.4 mL · min；运行时间：2 min。离子源参数为：气帘气温度350 ℃，气帘气流速11 mL · min，去簇电压4 000 V，其他质谱条件详见表1。

表1 咯菌腈的质谱检测参数

咯菌腈标准曲线的制作：配制浓度为0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg · mL的6 个系列标准溶液，摇匀，按照仪器检测条件，以峰面积为纵坐标，浓度（μg · mL）为横坐标进行线性回归分析。

1.3 数据分析

利用DPS 7.5（DPSSOFTDPSW.TXT）软件对试验数据进行统计分析，运用LSD 最小显著性法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 咪鲜胺和咯菌腈复配剂对番茄枯萎病发病情况的影响

从表2 可以看出，接种枯萎病菌的番茄植株均发病，但不同处理的发病率和病情指数有所差异。咪鲜胺和咯菌腈对番茄枯萎病均有治疗效果，尤其复配剂的治疗效果更明显，施药后30～50 d 植株的发病症状不再扩展，原来的病叶脱落，其他叶片及新叶表现正常；3 个药剂处理的枯萎病发病率和病情指数均随药剂施用时间呈先上升后下降的变化趋势，施药后50 d 咪鲜胺和咯菌腈复配剂处理的枯萎病发病率为33.33%，病情指数为28.33，明显低于各单剂处理。

表2 咪鲜胺和咯菌腈复配剂对番茄枯萎病发病情况的影响

2.2 咪鲜胺和咯菌腈复配剂对番茄枯萎病的防治效果

从表3可以看出，浓度为10mg·L的 咪鲜胺、咯菌腈单剂以及两者的复配剂对番茄枯萎病均具有防治效果，施用咪鲜胺和咯菌腈单剂后10～50 d 的防治效果分别为18.90%～60.61%和24.17%～53.33%，施用复配剂后10～50 d 后的防治效果为36.53%～71.67%；施药20 d 后，咪鲜胺和咯菌腈复配剂的防治效果高于单剂。

表3 咪鲜胺和咯菌腈复配剂对番茄枯萎病的防治效果

2.3 咪鲜胺和咯菌腈复配剂对番茄茎部病斑长度、株高和根长的影响

施药50 d 后，咪鲜胺和咯菌腈复配剂、咪鲜胺单剂和咯菌腈单剂处理的番茄植株茎部病斑长度分别为0.2、1.1、1.4 cm，均显著低于清水对照，复配剂处理的茎部病斑长度还显著小于咯菌腈单剂处理；株高分别为32.1、27.1、26.9 cm，复配剂处理与未接种病菌空白对照的株高差异不显著，但2个单剂处理的株高显著低于空白对照；根长分别为8.0、7.7、7.2 cm，均显著低于未接种病菌的空白对照（表4、图1）。

表4 咪鲜胺和咯菌腈复配剂对番茄茎部病斑长度、株高和根长的影响

图1 咪鲜胺和咯菌腈复配剂对接种枯萎病菌的番茄植株生长的影响

2.4 咪鲜胺及咯菌腈残留测定

2.4.1 咪鲜胺标准曲线 以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，建立线性方程。2，4，6-三氯苯酚在0.01～5.00 μg · mL范围内，其浓度咯菌腈与响应值有良好的线性关系，线性方程=2 307.6+203.9，=0.999 3。

2.4.2 咯菌腈标准曲线 以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，建立线性方程。咯菌腈在0.01～5.00 μg · mL范围内，其浓度与响应值有良好的线性关系，线性方程=2 350.9+3.475，=0.999 4。

2.4.3 咪鲜胺及咯菌腈残留分析 从表5 可以看出，施用咪鲜胺单剂、咪鲜胺和咯菌腈复配剂50 d 后，在番茄茎和叶片中均没有检测出咪鲜胺及其最终代谢物2，4，6-三氯苯酚；土壤中咪鲜胺的最终残留量分别为0.30～0.40 mg · kg和0.10 mg · kg，2，4，6-三氯苯酚的最终残留量分别为0.60～0.90 mg · kg和0.20～0.30 mg · kg。施用咯菌腈单剂、咪鲜胺和咯菌腈复配剂50 d 后，咯菌腈在番茄叶片中的最终残留量均小于0.01 mg · kg，在茎中的最终残留量分别为0.03～0.04 mg · kg和0.01～0.06 mg · kg，在土壤中的最终残留量分别为2.11～2.28 mg · kg和1.56～1.67 mg · kg，均小于GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定的咯菌腈在番茄中最大残留限量3 mg · kg。

表5 咪鲜胺、2，4，6-三氯苯酚和咯菌腈在土壤、番茄茎和叶片中的最终残留量

3 结论与讨论

目前，咪鲜胺和咯菌腈单剂或复配剂常用于防治番茄枯萎病，比如用0.4 mg · mL咪鲜胺防治大棚水培番茄枯萎病，防治效果为69.6%（Song et al.，2004）；80%乙蒜素乳油与25 g · L咯菌腈悬浮种衣剂或30%嘧菌酯悬浮剂的复配剂比单剂的防治效果更好，校正防效高达93.6%、89.1%（林辉 等，2018）。本试验结果表明，盆栽番茄施药后50 d，浓度均为10 mg · L的咪鲜胺和咯菌腈按2∶8配制的复配剂对番茄枯萎病的防效为71.67%，明显高于咪鲜胺单剂和咯菌腈单剂对番茄枯萎病的防效（52.50%和53.33%）。试验过程发现，施药后10～50 d，番茄枯萎病的发病率和病情指数均呈先升高后降低的变化趋势，这是因为施药处理是在接种枯萎病菌10 d 后进行的，药剂处理前病原菌已侵染番茄植株，逐渐表现出枯萎病症状，药效发挥作用后发病程度较轻的病叶脱落，新叶不再发病，部分发病植株恢复健康，再次统计发病情况时成为健康植株，说明该复配剂在一定时间有治疗番茄枯萎病的作用，但并不能说明复配药剂的持效期可达50 d。陈莉等（2012）在筛选防治稻曲病的药剂试验中发现，1 mg · mL烯唑醇和咪鲜胺复配剂（1∶10）对稻曲病菌的毒力作用强，30.0%烯唑醇和咪鲜胺可湿性粉剂复配的田间防效为79.2%，高于单剂。本试验中，在施用咪鲜胺和咯菌腈复配剂30～50 d 后，番茄枯萎病的病情指数从58.33 下降到28.33，均明显低于咪鲜胺单剂和咯菌腈单剂处理，说明复配剂对番茄枯萎病的防治起到了增效的作用。

目前我国《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）规定咯菌腈在番茄中的最大残留限量为3 mg · kg，咪鲜胺在旱粮类、黄瓜、苹果和蘑菇中的最大残留限量值分别为2、1、2、2 mg · kg，但尚未制定咪鲜胺在番茄上的最大残留限量标准。本试验中，施用咪鲜胺、咯菌腈单剂及其复配剂50 d 后，在番茄茎和叶片中均未检出咪鲜胺及其最终代谢物2，4，6-三氯苯酚，咯菌腈的最终残留量分别小于0.06 mg · kg和0.01 mg · kg，使用安全，可以为防治番茄枯萎病农药减量增效提供重要依据。