板栗愈伤组织瞬时转化体系的优化与应用

于文杰，楚天舒，宋 丽，葛婧怡，秦 岭，邢 宇

(北京农学院 植物科学技术学院，北京 102206)

板栗(Castaneamollissima)原产于中国，广泛分布于中国26个省份，且栽培种植历史悠久，具有较强的抗逆性和环境适应性[1]。板栗作为中国木本粮食树种之一，果实富含淀粉、可溶性糖、矿物质等多种营养物质，其中栗仁的干物质中淀粉占46%～64%[2]。板栗淀粉属于高档淀粉，可以代替主粮食用，可制成高级糕点，支链淀粉是板栗淀粉的主要成分，占总淀粉的70%左右[3]。支链淀粉和直链淀粉的比例对板栗的糯性影响较大，对板栗品质和食用口感有着较大的影响，因此研究板栗淀粉的合成机理对于品种的改良具有重要意义。

淀粉的生物合成需要几种酶的协同作用，包括可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SSS)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、颗粒结合淀粉合成酶(granule bound starch synthase, GBSS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)、淀粉去分支酶(starch debranching enzyme, DBE)等。所有已知的SSS类酶都在质体基质中被发现，并被认为是支链淀粉合成的主要原因[4]。目前已鉴定出四类SSS类酶：SSⅠ(soluble starch synthase Ⅰ)、SSⅡ(soluble starch synthase Ⅱ)、SSⅢ(soluble starch synthase Ⅲ)和SSⅣ(soluble starch synthase Ⅳ)[5-6]，每一类在淀粉的生物合成中都有特定的作用，而且每一类的活性不能被剩余的一个或多个完全补充[7]。这些酶普遍存在于淀粉合成细胞中,但是根据植物种类和组织的不同而活性不同[8]。在水稻胚乳发育中，SSⅠ的活性高于SSⅢ，而SSⅡ和SSⅢ在马铃薯(Solanumtuberosum)块茎[9]和豌豆(Pisumsativum)胚[10]中的活性高于SSⅠ。SSⅠ在谷类植物淀粉的生物合成中也起着重要作用，并且没有亚型[11]。在板栗中，CmSSⅠ 和CmSSⅢ 在板栗坚果发育时期表达上调，是参与淀粉积累的重要基因。但是这些基因对板栗直链淀粉和支链淀粉合成影响的研究报道较少[12]，该研究通过验证CmSSⅠ 在板栗淀粉合成中所起的作用，以期完善板栗淀粉合成过程中的分子积累机理。

基因功能的研究需要良好的遗传体系，在栗属植物中国板栗、美洲栗(Castaneadentata)、欧洲栗(Castaneasativa)中都已建立以胚性愈伤组织为受体的稳定遗传转化体系[13-15]，但胚性愈伤组织的诱导难度大，诱导数量少，而且在胚性愈伤组织生长发育的不同阶段还需要更换不同种类的培养基(E1胚启动培养基→E4胚萌发培养基)，操作复杂且实验时期较长。苹果(Malusdomestica)、柑橘(Citrusreticulata)和荔枝(Litchichinensis)等建立的稳定遗传转化体系中，同样存在转化效率低、时间成本高等问题[16-19]。对于需要简单、高效、快捷基因功能的研究工作而言，农杆菌介导的瞬时转化能够更加快速地进行基因功能初步验证和相应的表型鉴定。该技术已广泛应用于葡萄(Vitisvinifera)、甘草(Glycyrrhizauralensis)和黄芪(Astragalusmongholicus)等多种植物[20-21]。本课题组已初步建立农杆菌介导的板栗愈伤组织瞬时转化体系[22]，由于体系不稳定，转化效率低(26.86%)，需要多次试验才能获得转基因材料。因此，本研究优化板栗愈伤组织瞬时转化体系，并利用该体系对板栗淀粉合成酶基因功能进行鉴定，以期提高板栗愈伤组织瞬时转化效率的稳定性，并为板栗淀粉合成机理的探究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

本试验材料为北京市怀柔区板栗技术试验与推广站的板栗品种‘燕山红栗’，愈伤组织由花后45～54 d未成熟的子叶胚尖诱导。

1.2 试验方法

1.2.1 板栗愈伤组织的诱导及培养板栗愈伤组织的诱导参考Lu等的方法[23]，将板栗胚尖接种到IMM(2.3 g/L WPM + 0.109 g/L Vitamins + 30 g/L蔗糖+ 0.002 g/L 2,4-D+ 0.5 g/L L-glu)培养基上，诱导成功的材料接种至固体E1培养基(2.3 g/L WPM + 109 mg/L Vitamins + 1 g/L水解酪蛋白+ 1.8 μmol/L 2,4-D+ 1.1 μmol/L 6-BA+30 g/L蔗糖+3 g/L植物凝胶)上，在温度23～25 ℃上暗培养14 d。

1.2.2 板栗愈伤转化板栗愈伤组织瞬时转化方法参考美洲栗转化方法[24]。以不同状态的板栗愈伤组织为转化受体，将4种空载体的质粒分别转化到农杆菌GV3101中，挑取携带目的基因的根癌农杆菌单菌落接种于LB液体培养基中(0.05 g/L利福平+0.05 g/L壮观霉素或0.05 g/L卡那霉素)，28 ℃、220 r/min振荡过夜培养至菌液浓度OD600为0.8～1.2，取50 mL菌液于离心管中，3 500 r/min集菌15 min，倒掉上清液，将离心好的菌块重悬浮于Vir缓冲液(2.3 g/L MES + 1.98 g/L WPM + 2 g/L蔗糖，0.05 g/L AS)中。将重悬浮液放置于恒温摇床，在22 ℃、75 r/min的条件下培养3 h。称取不同状态愈伤0.3 g于15 mL离心管,加5 mL重悬浮液没过愈伤，封口膜缠紧后绑在360°垂直旋转混合仪上，35 r/min，混合时间为1 h。将侵染后的愈伤在灭菌干燥滤纸上吸干菌液，后将愈伤堆成豌豆粒大小的球形，放置于E1培养基上，暗培养2～3 d。

1.2.3 不同载体瞬时表达差异的比较将表达载体pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277、pBI121、Super1300、pCAMBIA1304分别转化到农杆菌菌株GV3101中，以上述转化方法对板栗愈伤组织进行侵染，侵染结束后以非转基因板栗愈伤组织作为对照，分别在共培养7 和14 d时于倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况并统计瞬时转化效率，比较不同载体瞬时表达的差异，从而筛选同等侵染条件下瞬时表达最好的载体。每次试验设置3次重复。

1.2.4 板栗淀粉合成酶基因CmSSⅠ 沉默载体的构建设计CmSSⅠ 基因特异性片段上游引物(5′-CTCTTCTCTGCTCGTCTC-3′)和下游引物(5′-TTGTTTGGGTTCTCATCTTTAG-3′)，引物退火温度为56 ℃。通过gateway体系[25]，构建pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277-CmSSⅠ 沉默载体。

1.2.5CmSSⅠ 实时荧光定量PCR检测愈伤中RNA提取试剂盒为Plant RNA Kit(Omega)，cDNA合成使用Reverse transcriptase M-MLV(TaKaRa)，使用TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)进行实时荧光定量PCR检测，反应体系按照产品说明书进行。反应仪器为CFX96(BIO-RAD)。通过软件Primer5设计CmSSⅠ 荧光定量上游引物(5′-CTCTTCTCTGCTCGTCTC-3′)和下游引物(5′-GAACCAGAGCCATAGCCATCCAAC-3′)，退火温度为58 ℃。内参基因使用的是CmActin。每个样品进行3次重复。

1.2.6 板栗愈伤组织淀粉积累观察及淀粉含量测定取微量板栗愈伤组织平铺于载玻片上。在体式荧光显微镜下观察到目标愈伤组织后向愈伤组织中缓慢滴加0.5%碘溶液，20 s后用吸水纸吸去多余液体后，在显微镜下观察，细胞内的淀粉经碘液染色变为深棕色。愈伤淀粉含量通过改良后的硝酸钙浸提法提取[26]。

1.2.7 数据分析采用SPSS 20.0进行数据统计分析，Excel 2010作图。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织状态筛选

根据胚启动的难易程度将板栗愈伤组织分为胚性愈伤组织(EC_E)和胚性愈伤组织早期阶段(EC_D)。根据颜色和质地对胚性愈伤组织早期阶段(EC_D)进行分类(图1)，分别为浅褐色且质地粘稠(Ⅰ)、乳白至浅黄色且质地处于前两者间(Ⅱ)、白色且质地相对分散(Ⅲ)，分别命名为EC_D(Ⅰ)、EC_D(Ⅱ)、EC_D(Ⅲ)。比较4种状态的愈伤得知，EC_D(Ⅲ)更为松散白嫩，可能更利于农杆菌的侵染。

2.2 不同状态的愈伤组织瞬时转化效率的比较

用携带报告基因DsRed的空载体pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277转化农杆菌，侵染胚性愈伤组织(EC_E)和胚性愈伤组织早期阶段EC_D(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，分别在共培养7 和14 d时在荧光倒置显微镜下观察其荧光表达情况，结果如图2显示：EC_D(Ⅲ)的瞬时转化效率最佳。共培养7 d时，4种不同状态的愈伤组织均有荧光表达，EC_E的荧光表达效果较EC_D(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的荧光表达效果弱，EC_D(Ⅲ)的荧光表达效果最强。在共培养14 d时，4种愈伤组织所表达的荧光有所加强，对照组EC_E表达的荧光弱于EC_D(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，荧光表达效果最好的仍然是EC_D(Ⅲ)，说明这4种愈伤组织在相同侵染条件下，EC_D(Ⅲ)的荧光表达效果最好(图2)。

2.3 不同载体对板栗愈伤瞬时转化效率的影响

为进一步优化瞬时转化体系，选取带有报告基因的载体进行转化侵染。RNAi沉默载体选择携带报告基因DsRed的pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277。过表达载体选择带有GFP报告基因的pBI121及带有eGFP报告基因的Super1300和pCAMBIA1304，pCAMBIA1304属于pCAMBIA系列载体，具有高拷贝和多克隆位点且酶切位点较多等特点。转化结果(图3)显示，在侵染条件相同的情况下，沉默载体pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277的瞬时表达效果最好。在3种过表达载体Super1300、pCAMBIA1304、pBI121的侵染实验中，共培养14 d时，只有携带报告基因eGFP的空载体Super1300转化侵染愈伤组织表达的绿色荧光相对明显。在本试验所用的4种载体中，pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277转化农杆菌后，能够最早(7 d)表达相应的报告基因(DsRed)，在共培养时间相同的条件下，能观察到其所表达的荧光最为明亮。由图4可知，受体材料均为EC_D(Ⅲ)时，4种载体在14 d的瞬时转化效率由高到低依次为：沉默载体pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277(87.67%)>Super1300(78.31%)>pCAMBIA1304(61.10%)>pBI121(43.16%)。综上所述，在侵染条件相同的情况下，瞬时表达效果好的载体为RNAi沉默载体pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277。

2.4 利用瞬时转化体系的验证淀粉合成基因CmSSⅠ 的功能

构建板栗淀粉合成酶基因CmSSⅠ 的沉默载体，瞬时转化到愈伤组织中，提取DNA，利用pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277所带的卡那霉素(Kana)的抗性基因进行阳性鉴定，通过凝胶电泳图得知(图5，A)，利用该体系获得阳性愈伤组织材料。基因表达检测表明，实验组愈伤CmSSⅠ的表达量下降，沉默效率为82%(图5，B)。用0.5%的碘-碘化钾溶液对阳性愈伤组织进行染色，观察淀粉积累情况，相对转化空载体pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277愈伤组织而言，干扰CmSSⅠ 表达后的阳性愈伤组织颜色变浅(图5，C)。淀粉含量测定发现，沉默CmSSⅠ 后，总淀粉含量下降为61%，有极显著性变化(P<0.01)，支链淀粉含量下降为68%，直链淀粉的含量变化不明显。淀粉测定结果表明，沉默CmSSⅠ 后显著抑制了总淀粉和支链淀粉的合成，对直链淀粉没有显著影响(图5，D)。

3 讨 论

瞬时转化受体材料的状态和载体是影响转化效率的关键因素。在葡萄和苹果中，筛选得到的最适瞬时转化受体材料均为淡黄色且紧实致密的胚性愈伤组织[20,27]。本研究发现，白色且质地相对分散的胚性愈伤早期状态更适用于板栗的瞬时转化，说明不同树种瞬时转化的材料存在差异，因此筛选合适的愈伤组织可提高转化效率。此外，使用不同的载体也对瞬时转化效率有重要影响[28]，楸树瞬时转化体系选用的载体为PBI121[29]，苹果和葡萄中选用PCAMBIA0390载体的瞬时转化效率最佳[20,26]。本研究发现沉默载体pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277激发的RFP能够更快速的表达，通常转化7 d内能进行鉴定筛选；过表达载体激发的GFP或EGFP需要7～14 d表达周期才能进行鉴定筛选，过表达载体Super1300具有更高的转化效率。本研究优化后的板栗瞬时转化效率高达87.63%，较之前相比[22]，提高了60.77%，形成了以白色且质地相对分散的胚性愈伤早期状态为受体材料及载体为pK7GWIWG2(Ⅱ)RR-277的最佳体系，为进一步验证基因的功能提供较好的平台。

利用淀粉遇碘形成淀粉碘络合物并且会产生颜色变化的原理[30]，可用于检测淀粉合成相关基因在愈伤组织中的转化效果。SSS 作为淀粉合成关键酶，在淀粉合成过程中起着重要作用[31-32]。在板栗基因组中，4个淀粉合成关键酶基因(CmSSⅠ、CmSSⅡ、CmSSⅢ、CmSSⅣ)在板栗果实的发育过程中表达差异显著[33]，且发现基因CmSSⅠ 的表达与板栗坚果发育过程中淀粉的累积规律较为一致[34]。碘液染色后，被干扰CmSSⅠ 的愈伤组织着色变浅，通过对淀粉含量测定发现，支链淀粉和总淀粉含量显著性降低，直链淀粉含量变化不明显，证实了CmSSⅠ 促进板栗淀粉的合成，尤其是支链淀粉的合成，这与前人对SSⅠ 基因功能的研究相吻合[35-36]。以愈伤组织为转化材料还可以鉴定乙烯代谢以及花色苷合成基因的功能，在苹果愈伤中过表达MdAC01后，乙烯代谢速率提升，过表达花青苷调控基因MdERF109后，愈伤颜色加深，且花青苷含量显著提高[27,37]。证明了该体系更适用表型容易检测的基因功能验证。该体系有利于板栗淀粉合成基因功能的快速鉴定和筛选，为分子辅助育种奠定了基础。