不结球白菜表皮蜡质高温胁迫生理响应

火兆燕，曹 萍，马馨馨，王树彬，厉书豪，邵贵荣，钟凤林*

(1 福建农林大学 园艺学院，福州 350000;2 福建金品农业科技股份有限公司，福州 350000)

白菜类蔬菜包括大白菜(结球白菜)、小白菜(不结球白菜)、菜心、紫菜薹等，其中大白菜和小白菜是中国栽培广泛的绿叶类蔬菜作物[1]。不结球白菜(Brassicassp.chinensis)又名小白菜，属十字花科芸薹属[2]，适应性广，质地鲜嫩，营养丰富，生长周期短，复种指数高，是国家菜蓝子工程中重要的蔬菜作物之一[3]。不结球白菜喜冷凉气候条件，多数品种生长的最适平均气温为18～20 ℃，28 ℃以上高温条件下，节间伸长、生长迟缓，叶片易变黄、腐烂、味苦、病害严重，纤维含量明显增加等，影响其商品性，给小白菜的生产带来了严重的问题[4]。

表皮蜡质是一种附着于植物表皮组织的非细胞结构物质，作为植物组织的第一道保护性屏障，在抵御环境胁迫、保证植物正常生长发育等方面发挥着积极作用[5]。表皮蜡质在植物的非生物和生物胁迫耐受中起着重要的作用，并参与了对过量紫外线辐射、高温、细菌和真菌病原体、昆虫、高盐度和低温等的防御机制[6-7]。有研究表明甘蓝型油菜叶片蜡质的积累有利于维持植株体内水分平衡[8]。覆盖在白菜叶片表面的蜡质可以有效抑制害虫的侵害[9]。拟南芥中蜡质的积累，可以调节表皮细胞渗透性，增强植株耐热性[10]。表皮蜡质具有阻止植株非气孔水分流失，在植物抗逆性方面发挥重要作用[11]。目前在白菜中已鉴定出许多调控蜡质合成关键基因，且证明其与植株生长发育和抗逆性密切相关，但其抗逆性生理机制尚不清晰。为此本研究通过对高温胁迫下不结球白菜有蜡和无蜡材料表皮细胞形态及生理生化指标的测定，明晰不结球白菜蜡质响应高温胁迫的生理机制，为近一步探究蜡质响应高温的分子机制提供理论基础，也对不结球白菜耐热品种的选育及设施栽培提供一定的理论指导。

1 材料和方法

1.1 材料与处理

不结球白菜有蜡材料Q28和无蜡材料Q1202来源于福建金品农业科技股份有限公司。试验于 2021年 4-6月在福建农林大学园艺学院公共实验室的人工气候箱内进行。将3叶1心健壮不结球白菜幼苗移栽到盆中，每盆1株，覆土5 cm左右，定植后浇透水进行培养，昼/夜温度为 25 ℃/18 ℃，空气相对湿度为75%。4周后菜苗生长旺盛期进行高温处理。试验设高温组(昼/夜温度为37 ℃/30 ℃)和对照组(昼/夜温度为25 ℃/18 ℃)，共处理9 d，每处理设3次重复，每重复3株。在处理 3、6、和 9 d时分别采集植株的叶片，进行相关指标测定。试验期间，控制人工气候箱相对湿度为75%，光/暗周期为12 h/12 h，光合有效辐射为400 μmol·m-2·s-1。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 生物量及表皮细胞形态随机选取5株幼苗分别取地上地下部擦干称取鲜重后，放入烘箱105 ℃杀青15 min，后烘干至恒重，称取干重。叶片表皮细胞形态用台式扫描电子显微镜(TM3030 Plus，日本Hitachi 公司)进行观察、拍照。

1.2.2 抗性生理指标采用氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性，采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性[12]；采用浸泡法测定相对电导率[12]；采用硫酸蒽酮比色法测定可溶性糖含量，采用考马斯亮蓝 G-250法测定可溶性蛋白含量[12]；采用茚三酮比色法测定脯氨酸(Pro)含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定丙二醛(MDA)含量[13]。

1.2.3 光合生理指标采用比色法测定各处理不结球白菜叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量[14]。同时，用便携式光合测定系统(Li-6400, Li-Cor,USA)在晴天上午10:00～11:00点测定其光合气体交换参数，包括净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。测定时光强设为1 000 μmol·m-2·s-1，CO2浓度为400 μmol·mol-1，温度为25 ℃，相对湿度50%～60%。

1.3 数据分析

数据采用Excel 2016进行数据处理分析及作图，运用DPS(V3.01)进行差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对两种不结球白菜生物量的影响

随着高温胁迫时间的持续，两种不结球白菜材料幼苗干、鲜重均呈持续下降趋势；干旱胁迫过程中，有蜡材料始终高于同期无蜡材料，且胁迫时间越长两种材料差异越明显(表1)。其中，在高温胁迫9 d时，有蜡材料和无蜡材料的单株鲜重分别较高温胁迫前(0 d)显著降低17.58%和34.39%；有蜡材料的单株鲜重在高温胁迫3、6、9 d时均显著高于无蜡材料。同时，在高温胁迫9 d时，无蜡材料和有蜡材料的单株干重较0 d分别降低31.14%和16.23%，无蜡材料下降幅度是有蜡材料的2.1倍；在高温胁迫6、9 d时，有蜡材料单株干重均显著高于无蜡材料。说明高温胁迫后期，有蜡不结球白菜材料较无蜡材料更能平衡体内水分散失和维持自身物质积累以应对高温胁迫带来的伤害。

2.2 高温胁迫对两种不结球白菜叶片表皮细胞形态的影响

当植物受到外界环境胁迫时，叶片是最直接反映植株生长状态的器官之一[15]。随着高温胁迫时间的延长，有蜡不结球白菜材料叶片表皮细胞形态由趋近饱满状态逐渐转变至轻微皱缩状态；而无蜡不结球白菜材料表皮细胞形态表现出更早更明显皱缩状态，在处理3 d时就出现明显皱缩，至处理6 d时失水皱缩情况加深，到处理9 d时表皮细胞严重皱缩(图1)。说明随着高温胁迫的持续，有蜡材料叶片表皮细胞完整性较好，损伤较小，叶片含水量较高，能够通过自身调节来抵抗高温环境。

2.3 高温胁迫对两种不结球白菜叶片渗透调节能力的影响

随着高温胁迫时间的延长，有蜡材料叶片的脯氨酸含量呈先升高后降低再升高的变化趋势，并在胁迫9 d时达到最大值，此时比处理前升高1.57倍；无蜡材料叶片的脯氨酸含量则呈先下降后升高的动态变化趋势，但也在胁迫9 d时达到最大值，此时比处理前升高了85.84%；在高温胁迫9 d时，有蜡材料的脯氨酸含量显著高于无蜡材料(图2,A)。在高温胁迫后，有蜡材料叶片可溶性糖含量呈先降低后升高的趋势，并在胁迫处理9 d达到最大值，此时比处理前升高10.75%；无蜡材料叶片可溶性糖含量呈先升高后下降的动态变化，在处理6 d时达到最大值，此时比处理前升高57.32%；在高温胁迫0、3和9 d时，有蜡材料叶片的可溶性糖含量均显著高于无蜡材料(图2，B)。有蜡材料叶片可溶性蛋白含量呈先降低后升高再降低的变化趋势，在胁迫处理6 d时大幅度升高并达到最大值，其在胁迫9 d时又大幅度降低，比处理前下降48.47%；无蜡材料叶片可溶性蛋白含量整体呈下降趋势；在高温胁迫6和9 d时，有蜡材料叶片可溶性蛋白含量均显著高于无蜡材料(图2，C)。以上结果说明不结球白菜叶片表面蜡质的积累能在一定程度上提高植株的渗透调节能力。

2.4 高温胁迫对不结球白菜叶片抗氧化酶活性和细胞膜透性的影响

图3显示，在高温胁迫条件下，两种不结球白菜叶片的SOD、POD、CAT活性均呈现先升高后下降的动态变化趋势，有蜡材料始终高于无蜡材料，且两者间差异大多达到显著水平。其中，在高温胁迫后，有蜡材料和无蜡材料叶片的SOD活性分别在高温胁迫3 d和6 d时先后达到最大值，分别比处理前升高32.87%和29.9%(图3，A)。两份材料的POD活性均在高温胁迫6 d时达到最大值，有蜡材料和无蜡材料叶片的POD活性分别比胁迫前升高了41.72%和32.15%；在高温胁迫9 d时，无蜡材料叶片POD活性比处理前降低12.16%，而有蜡材料叶片POD活性仍比高温处理前升高11.17%(图3，B)。在高温胁迫前后，有蜡材料叶片的CAT活性均显著高于无蜡材料；有蜡材料叶片的CAT活性在胁迫前是无蜡材料的1.3倍；在高温胁迫3 d后，两种材料的CAT活性均达到峰值，有蜡材料和无蜡材料分别比高温处理前升高53.26%和42.67%(图3，C)。

同时，高温胁迫后,两种不结球白菜叶片相对电导率和丙二醛含量(MDA)均呈逐渐上升趋势，且无蜡材料的上升幅度更大。其中，有蜡材料叶片相对电导率在整个高温胁迫期间上升较缓慢，在胁迫3～9 d均显著低于同期无蜡材料，在高温胁迫9 d相对电导率较无蜡材料低22.25%(图3，D)。无蜡材料MDA含量在高温胁迫下上升幅度更大，始终显著高于有蜡材料(图3，E)。

2.5 高温胁迫对两种不结球白菜叶片光合色素含量的影响

高温胁迫下两种不结球白菜叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均呈明显下降的趋势，且随着胁迫时间的延长有蜡材料的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量明显高于无蜡材料(图4)。其中，在高温胁迫9 d时，有蜡材料和无蜡材料的总叶绿素含量分别较处理前下降43.9%和60.18%，且有蜡材料显著高于无蜡材料(图4，C)。同时，两种不结球白菜叶片类胡萝卜素含量随着高温胁迫的持续略有下降，但有蜡和无蜡材料之间不存在显著差异(图4，D)。

2.6 高温胁迫对两种不结球白菜叶片光合气体交换参数的影响

随着高温胁迫时间的延长，两种不结球白菜品种叶片的Tr、Pn、Gs均呈逐渐下降趋势(图5)。其中，有蜡材料的Pn始终不同程度地高于同期的无蜡材料，且高温胁迫6和9 d时达到显著水平，此时分别是无蜡材料的1.27、1.32倍；有蜡材料的Tr和Gs在整个胁迫过程中均始终显著低于同期无蜡材料，在高温胁迫3、6和9 d时，无蜡材料的Tr分别是有蜡材料的1.12、1.22、1.50倍，Gs分别是有蜡材料的1.15、1.20、1.36倍。同时，经不同天数的高温胁迫后，2份不结球白菜材料叶片Ci均呈逐渐上升趋势，且有蜡材料始终不同程度地低于无蜡材料，并在胁迫处理6和9 d时达到显著水平；在高温处理9 d时，有蜡材料和无蜡材料叶片Ci分别比处理前上升34.2%和83.6%。

3 讨 论

植物在生长期间会受到很多非生物因素的影响，在众多胁迫因素中，温度是影响植物生长的重要因素之一[16]。高温胁迫对植物生长的影响最终体现在植株生物量的积累上，因此植株生物量的变化能直接反映出植物对逆境的适应能力[17-18]。马宝鹏等[19]研究发现，高温胁迫后,辣椒的株高、地上地下部干鲜重以及壮苗指数均显著降低。前人研究结果[20]表明，高温对紫色不结球白菜品种的地上部生长有不同程度的抑制作用。本研究发现高温胁迫后，有蜡和无蜡不结球白菜植株鲜干重均受到抑制，且随着胁迫时间延长，抑制作用逐渐增强；在高温胁迫6、9 d时，无蜡材料的单株干重显著低于有蜡材料。

同时,相对电导率是衡量细胞膜透性的重要指标，与植物的抗逆性的大小密切相关[21]。在高温环境下，植物体细胞膜膜脂组分发生变化，使细胞器结构破坏，细胞膜通透性增大，细胞失水皱缩，电解质渗透率增大，从而导致电导率上升[22]。丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度以及对逆境的反应情况[23-24]。在本研究中，随着高温胁迫时间的延长，有蜡不结球白菜材料叶片失水皱缩程度和相对电导率显著小于无蜡材料，说明高温胁迫下有蜡材料叶片的细胞膜完整性损伤较小，能够通过自身调节抵抗高温环境。同时，随着高温胁迫持续，无蜡材料叶片中 MDA含量的上升趋势显著高于有蜡材料，高温胁迫处理9 d时MDA是有蜡材料的2倍。这表明高温胁迫下无蜡材料的叶片细胞液外渗严重，细胞膜结构损伤严重。

植物在遭受高温、干旱、盐碱等逆境时，会迅速积累脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等一系列渗透调节物质，从而提高植物防御能力[25]。脯氨酸的大量积累有利于平衡植物体内渗透势，具有降低细胞酸性、解氨毒、防止细胞脱水的作用[26]。可溶性糖通过渗透调节降低水势，保证植物细胞的正常生理功能。可溶性蛋白具有维持植物体渗透压、抗脱水的作用[27-28]。本研究结果表明，随着高温胁迫时间的增加，有蜡材料叶片脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的上升幅度都显著高于无蜡材料。说明高温胁迫下有蜡材料具有更好地调节细胞和环境渗透平衡、降低细胞膨压、缓解高温伤害的能力。

在一定程度上，植物体可以通过自身的抗氧化酶系统来防御高温毒害作用，从而保护细胞膜的完整性。超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内重要的抗氧化酶，具有极强的氧化能力，它能将有害的超氧自由基转化为过氧化氢[29]。而存在于植物体内的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)能立即将有害的过氧化氢分解为水，SOD、CAT、POD便组成了一个完整的防氧化链[30]。因此，SOD、POD、CAT的活性水平在一定程度上代表了细胞清除活性氧自由基的能力，也间接反映了植物抗高温的能力[31]。本试验结果表明，在高温胁迫后，有蜡和无蜡不结球白菜叶片的SOD、POD 和 CAT 活性均呈现先升高后降低的趋势，说明对于短时间内高温植物可以通过提高自身防御机制来应对胁迫。同时，有蜡材料叶片抗氧化酶活性的升高幅度均大于无蜡材料并始终高于处理前水平，又表明有蜡材料抵抗活性氧对机体伤害的能力较强，耐高温性较强。

高温可降低植物的光合作用。而叶绿素在植物光合作用的光吸收中起核心作用，其含量的高低直接影响植物叶片的光合作用[32]。研究表明，在高温胁迫下，两种不结球白菜叶绿素含量均下降，但仍以有蜡材料的含量较高。影响植物光合效率的因素主要有气孔限制和非气孔限制，气孔限制因素引起的Pn下降表现为Gs、Ci、Tr的下降，非气孔限制因素引起的Pn下降表现为Tr、Gs下降的同时Ci上升[33-34]。本研究结果表明，在高温胁迫下，两种不结球白菜叶片Pn、Gs和Tr显著降低，Ci显著上升，说明高温胁迫下非气孔因素是引起不结球白菜光合速率下降的主要原因[35]。随着高温胁迫的持续，有蜡材料的蒸腾速率相对较小，可能是因为叶片上蜡质的积累导致植株角质层的渗透性降低，从而限制了蒸腾作用[36]。

4 结 论

高温胁迫对有蜡和无蜡不结球白菜的叶片表皮形态、生理和光合水平均有不同程度的影响。对于2份材料而言，高温胁迫下无蜡材料叶片表皮细胞的失水皱缩程度大于有蜡材料。但从生理指标方面看，有蜡材料在高温胁迫下的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸、抗氧化酶活性、净光合速率都显著高于无蜡材料。而无蜡材料在高温胁迫下的相对电导率、丙二醛含量、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2浓度明显高于有蜡材料。在相同高温胁迫条件下有蜡材料受伤害程度小于无蜡材料，是由于蜡质保护叶片表皮细胞，平衡植株体内水分散失，降低植株角质层渗透，增强抗氧化能力，减少蒸腾速率，提高光合速率，使有蜡材料对高温的适应性优于无蜡材料。本研究明晰了不结球白菜有蜡和无蜡材料在高温胁迫下表皮细胞形态、生物量、生理水平的差异，揭示了蜡质不结球白菜响应高温胁迫的相关生理机制，该研究结果为不结球白菜耐热品种的选育以及进一步分析不结球白菜表皮蜡质响应高温胁迫的分子机制提供了理论依据。