粘质沙雷氏菌对抗BmNPV家蚕品种皖·丰×润康的致病力测定

张 勇 秦 凤 张 彦 童晓琪 黄 浩 徐 浩 孙健诚 黄德辉 石 凉

(1六安市金安区农产品质量安全中心，安徽六安 237000； 2安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061)

家蚕在饲养过程中易受病原微生物的侵染，家蚕核型多角体病毒(BmNPV)病是养蚕生产中最严重的一种蚕病[1]，具有极强的传染性和致病性，除彻底消毒和严格按照规范化技术饲养外，培育抗BmNPV家蚕品种是应对BmNPV最经济有效的手段[2]。近年来，我国已先后育成多个抗BmNPV家蚕实用新品种，如华康系列品种[3-4]、华康×湘泰[5]、桂蚕N2[6]、粤蚕11号[7]等已在生产中推广应用。安徽省农业科学院蚕桑研究所育成的家蚕品种皖·丰×润康也具有显著抗BmNPV的效果，其对BmNPV多角体的半数致死浓度(LC50)值在108～1014个/mL之间(未发表)，显著强于现行国家蚕品种试验对照种秋丰×白玉。

虽然抗BmNPV家蚕新品种在对BmNPV的抗性方面得到了显著提高，但从近年推广区域的实际情况看，此类品种易受细菌病原危害，在高温、多湿季节或地区尤为明显，常常给蚕桑生产带来一定损失。据报道[8]，从养蚕场所分离到的细菌50%对家蚕有致病力，其中80%为沙雷氏菌属(Serratiamarcescens)，引起家蚕的灵菌败血病。为了解细菌对抗BmNPV家蚕新品种皖·丰×润康(一代杂交种)的致病力，以粘质沙雷氏菌为试验菌，以秋丰×白玉为对照家蚕品种，于2021年夏季开展梯度浓度的粘质沙雷氏菌悬液经体壁穿刺接种试验，调查了2个家蚕品种的半数致死时间(LT50)，以期为抗BmNPV家蚕品种对细菌病的抗性提供相关信息与借鉴资料，为蚕业生产中合理饲养抗BmNPV家蚕品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试家蚕品种 抗BmNPV家蚕品种：皖·丰×润康，由安徽省农业科学院蚕桑研究所家蚕研究室提供；对照家蚕品种：秋丰×白玉，由浙江省蚕种质量检验检疫站提供。2个品种的家蚕正反交均由6个蛾区混合收蚁，常规催青，正常条件下普通桑叶育饲养至4龄眠，5龄起蚕后供LT50测定试验用。

1.1.2 主要试剂 营养琼脂培养基，南京乐诊生物技术有限公司产品；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒，生工生物工程(上海)有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 家蚕粘质沙雷氏菌株的分离和纯化 蚕室内采集到自然感染灵菌败血病的病蚕，先用75%的酒精将蚕体表面消毒，在无菌条件下，用昆虫针刺破其体壁，无菌环沾取体液，在营养琼脂培养基上划线，于28 ℃培养24 h后，挑取单菌落。将纯化后的粘质沙雷氏菌株，挑取单菌落制成菌悬液，重复感染健康5龄起蚕，收集死亡症状相同的家蚕个体，按前述方法进行粘质沙雷氏菌的再分离，保留并培养特征完全相同的菌株，即得到纯化的家蚕粘质沙雷氏菌株。

1.2.2 粘质沙雷氏菌的分子鉴定 为进一步确定得到菌株的种属，利用16S rDNA方法对其进行鉴定。用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取分离菌株的基因组。设计16S rDNA通用引物，上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，进行PCR扩增。PCR反应条件：96 ℃预变性5 min，96 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，16 ℃终止反应。取3 μL的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶检测，PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI进行Blast比对鉴定菌株。

1.2.3 菌液的制备 将分离纯化后的家蚕粘质沙雷氏菌株用营养琼脂培养基培养，挑取单菌落制成菌悬液，采用平板菌落计数法[9]计算菌悬液浓度，用无菌水稀释成1×107、1×106、1×105cfu/mL等3个试验所需的浓度梯度菌液。

1.2.4 粘质沙雷氏菌对家蚕不同品种的致病力测定 将粘质沙雷氏菌悬液每个浓度设3个重复，每个重复30头5龄起蚕，采用体壁穿刺法接种[10]，试验组每只家蚕经体壁用微量注射器注射接种1 μL菌液，对照组每只家蚕从体壁注射接种1 μL无菌水。接种后所有家蚕均用正常桑叶在24 ℃下饲养，连续观察24 h，每1 h定时记录家蚕幼虫的死亡头数，并将死亡的蚕体挑出单独放置，观察是否为灵菌败血病感染致死。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析，建立直线回归模型，计算LT50，以LT50为判断粘质沙雷氏菌对不同品种之间致病力强弱的指标。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的分子鉴定

该菌株在营养琼脂培养基上形成圆形的红色菌落，菌落边缘整齐、湿润。分离得到粘质沙雷氏菌的PCR产物，测得序列为1 477 bp，对结果进行NCBI-blast，对BLAST结果进行分析，发现分离菌株16S rDNA序列与Serratiamarcescensstrain S7.1 chromosome亲源关系最近，其相似性达到100%，综合其生物学特征，分离菌株被鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。

2.2 不同家蚕品种注射不同浓度的粘质沙雷氏菌悬液后的发病情况

注射粘质沙雷氏菌悬液后，不同浓度菌液均引起2个品种的家蚕快速发病死亡，而注射无菌水的对照组均未发病。发病初期蚕体僵硬、胸部膨大，蚕体缩短，吐出肠液，死亡，几个小时后皮肤松弛，病蚕尸体逐渐软化全身变成红色。粘质沙雷氏菌对2个家蚕品种5龄幼虫均有较强的致病力，随着粘质沙雷氏菌菌液浓度的增加，对家蚕的致病力逐渐增强，以1×107cfu/mL浓度下的致病力最强，致死时间最短，皖·丰×润康正反交平均最早在注射后13.0 h发生死亡，而秋丰×白玉正反交平均时间为13.5 h。

2.3 粘质沙雷氏菌对皖·丰×润康的致病力

从表1可以看出，随着粘质沙雷氏菌菌液浓度的降低，其对皖·丰×润康和秋丰×白玉的致病力均逐渐减弱，LT50逐渐延长。其中以1×107cfu/mL浓度的致病力最强，其对皖·丰×润康正反交幼虫的LT50分别为15.6 h和14.4 h，对秋丰×白玉正反交幼虫的LT50分别为16.2 h和15.7 h；以1×105cfu/mL浓度的致病力最弱，对皖·丰×润康正反交幼虫的LT50分别为16.9 h和16.0 h，对秋丰×白玉正反交幼虫的LT50分别为17.0 h和16.9 h；1×106cfu/mL浓度的致病力介于1×107和1×105cfu/mL之间，对皖·丰×润康正反交幼虫的LT50分别为16.2 h和15.5 h，对秋丰×白玉正反交幼虫的LT50分别为16.4 h和16.2 h。粘质沙雷氏菌对皖·丰×润康和秋丰×白玉正反交之间的致病力略有差异，同一浓度下，反交的LT50均短于正交。另外，感染同一浓度粘质沙雷氏菌后，抗BmNPV家蚕品种皖·丰×润康正反交的LT50平均比对照家蚕品种秋丰×白玉正反交的LT50缩短0.6 h，说明抗BmNPV家蚕品种皖·丰×润康对抵御粘质沙雷氏菌没有优势。

表1 粘质沙雷氏菌对皖·丰×润康正反交的半数致死时间(LT50)

3 讨论

沙雷氏菌属是养蚕环境中广泛存在，同时具有较强致病力的一种病原菌。本研究结果表明，抗BmNPV家蚕实用新品种皖·丰×润康正反交在粘质沙雷氏菌菌液浓度为1×107cfu/mL时LT50最短为15.6 h和14.4 h，在菌液浓度为1×105cfu/mL时LT50最长为16.9 h和16.0 h；粘质沙雷氏菌对秋丰×白玉的致病力作用出现相同的趋势，在相同浓度下抗BmNPV家蚕品种皖·丰×润康正反交的LT50平均比对照家蚕品种秋丰×白玉正反交的LT50短0.6 h，说明抗BmNPV家蚕品种皖·丰×润康对细菌病更加敏感，对抵御粘质沙雷氏菌没有优势。

BmNPV病毒的感染取决于宿主和环境之间的相互作用，宿主因素包括家蚕自身抗性的差异和免疫调节机制，调节抗病毒免疫反应，决定病毒的清除和传播。有研究表明[11]，细菌及其产物会对病毒的稳定性和传染性产生不利影响。通过小鼠粪便移植将分节丝状菌转移至易感动物体内，可以保护易感动物免受甲型流感病毒(Influenza A virus)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)和呼肠孤病毒(Reovirus)的感染[12]。Surfacetin是枯草芽孢杆菌产生的一种具有膜破坏特性的环状脂肽，可破坏冠状病毒粒子的完整性[13]，并损害几种包膜病毒的传染性，包括基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、杜贝病毒(Dugbe virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、甲型流感病毒、马雅罗病毒(Mayaro virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、乌纳病毒(Una virus)和寨卡病毒(Zika virus)[14]，但抗病毒宿主影响细菌的传染力相关文献在国内外还未见报道。

家蚕品种间对BmNPV抵抗性存在显著差异，可以利用高抗BmNPV的品种资源，通过杂交、回交等技术手段，将抗BmNPV基因导入实用性基础品种中，培育出抗BmNPV生产实用新品种。随着我国经济快速发展和蚕业生产方式的根本性变化，养蚕从业人员老龄化成为普遍现象；新型蚕业经营主体发展迅猛，轻简化、规模化养蚕在一定程度上带来蚕病高发的风险，也对家蚕品种的抗病、抗逆性提出更高要求，推广抗BmNPV家蚕品种成为养蚕生产中最有效的途径和手段，也是确保其高产稳产的重要措施。因此，弄清细菌对该类品种的致病规律，对蚕病综合防治和蚕茧高产稳产都有积极意义，而细菌对抗BmNPV家蚕品种致病的分子机制值得进一步研究。