寄生桑树的粗毛纤孔菌母种培养基最佳碳源和氮源筛选

宋洪燕 郭 光 任鹏飞 韩建东 宫志远

(1山东省蚕业研究所，山东烟台 264002； 2山东省农业科学院农业资源与环境研究所，山东济南 250100)

粗毛纤孔菌俗名粗毛黄孔菌或粗毛黄褐孔菌，按照现代分类系统该菌属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、锈革孔菌目(Hymenochaetales)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、纤孔菌属(Inonotus)[1]。该菌以寄生为主，寄主有杨树、水曲柳、榆树、日本槐和桑树等，是一种生长在温带的木腐菌，主要生长在活立木，偶见长于倒木上。经专家考证，粗毛纤孔菌(Inonotushispidus)即为古代中药“桑黄”[2-3]，含有丰富的多糖、多酚、三萜以及多种活性物质[4-8]，是一种十分珍贵的药用真菌，具有抗肿瘤[9]、降血糖[10]、降血脂[11]、抗病毒[12]、抗炎[13]、活血化瘀[14-15]、保肝[16]、免疫活性[17]、抗氧化和抑菌活性[18]等药理作用。

食用菌母种培养基是实验室及菌种生产部门保存菌种的关键，同时还是生产上制备原种的重要依据[19]；因此，为了明确粗毛纤孔菌生长发育的基础，了解其营养特性，本试验研究了母种培养基中不同碳、氮源对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响，旨在为粗毛纤孔菌的规模化、工厂化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种 粗毛纤孔菌，采自山东夏津黄河故道古桑树群，保存于山东省蚕业研究所。

1.1.2 主要试剂 选用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉5种常用碳源，蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、硫酸铵、大豆粉5种常用氮源，以及磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、新鲜马铃薯。其中，葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁，分析纯，均为天津市致远化学试剂有限公司产品；乳糖、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉，生物试剂，均为北京奥博星生物技术有限公司产品；蔗糖，分析纯，上海展云化工有限公司产品；琼脂，生物试剂，天津市致远化学试剂有限公司产品；马铃薯、大豆粉，均为市售成品。

1.1.3 主要仪器设备 1 000 mL、250 mL三角瓶，四川蜀牛玻璃仪器有限公司产品；直径7 cm一次性塑料平板培养皿，比克曼生物科技有限公司产品；YXQ-LS-75SⅡ立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司产品；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，上海苏净实业有限公司产品；玻璃试管，四川蜀牛玻璃仪器有限公司产品；5D Mark Ⅲ佳能数码相机，佳能(中国)有限公司产品；美的26 cm不锈钢蒸锅、C21-Simple103美的电磁炉，广东美的生活电器制造有限公司产品；LQ-C5003电子天平，昆山优科维特电子科技有限公司产品。

1.2 培养基的制作

1.2.1 PDA斜面培养基 逐一称取去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g。将去皮马铃薯切小块加蒸馏水蒸煮20～30 min，4层纱布趁热过滤，取滤液，加入葡萄糖、琼脂混合均匀，用1 000 mL三角瓶加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀，倒入玻璃试管，硅胶塞封口，10支1组，用牛皮纸包裹，橡皮筋捆绑好，放入压力蒸汽灭菌器中灭菌，温度为121 ℃，时间为20～25 min。灭菌结束后将试管取出，倾斜45°放置制成斜面培养基，冷却后待用。

1.2.2 CPDA平板培养基 逐一称取去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂20 g。蒸煮、定容按1.2.1项进行，分装至250 mL三角瓶进行灭菌，方法同1.2.1项，灭菌结束后在无菌净化工作台制成平板培养基。

1.2.3 碳源供试平板培养基 蛋白胨5 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂20 g，待加入不同碳源灭菌、浇制，制作方法同1.2.2项。

1.2.4 氮源供试平板培养基 葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，琼脂20 g，待加入不同氮源后灭菌、浇制，制作方法同1.2.2项。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化 将粗毛纤孔菌菌种从4 ℃冰箱中取出后，28 ℃下恒温放置1 d，在无菌条件下把活化菌种接种于PDA斜面培养基上，28 ℃下恒温培养3～4 d后挑取菌丝生长前端，转接于CPDA平板培养基上，28 ℃下恒温培养12 d左右，待菌丝长满平板作为试验种备用。

1.3.2 碳源筛选试验 将相同质量(20 g)葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉5种碳源分别加入碳源供试培养基，进行碳源筛选试验，每处理设3个重复。

1.3.3 氮源筛选试验 将相同质量(5 g)蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、硫酸铵、大豆粉5种氮源分别加入氮源供试培养基，进行氮源筛选试验，每处理设3个重复。

1.3.4 接种 在无菌净化工作台上，用直径5 mm的打孔器将活化后的粗毛纤孔菌菌种取相同菌龄的菌块，每个平板培养基接种1块于中心位置，用封口膜封住，放入28 ℃恒温培养箱黑暗培养7 d，取出，测量菌落面积，并观察记录菌丝生长势。菌丝生长势用致密、密实、细密、稀疏表示，为依次减弱顺序。

1.4 数据分析

为减少测量试验误差，本试验采用7日菌落生长面积代替常用的每日测量菌落直径求平均值的方法作为分析指标。菌落面积测量采用Image J软件分析，试验数据采用Excel2013和SPSS20.0 软件进行分析，多重比较采用Tukey HSD检验法。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响情况

从图1和表1可以看出，在相同培养条件下，粗毛纤孔菌菌丝在5种碳源培养基上都可以生长，但菌丝生长情况存在明显不同，各处理间差异较大，这说明粗毛纤孔菌对碳源的利用是有选择性的。从本次试验中得出，在相同培养条件下，果糖培养基上该菌种的菌丝生长势最强(颜色呈浅黄色，菌丝边缘生长整齐，菌丝致密)，7日菌落生长面积最大，达1 063.827 mm2，与葡萄糖(615.641 mm2)、蔗糖(673.514 mm2)、乳糖(130.482 mm2)、可溶性淀粉(100.517 mm2)等其他4种碳源相比呈极显著差异。由此得出，在相同培养条件下，适宜粗毛纤孔菌菌丝生长的最佳碳源是果糖。

C1、C2、C3、C4、C5分别表示葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可 溶性淀粉等不同碳源培养基，N1、N2、N3、N4、N5分别表示 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、硫酸铵、大豆粉等不同氮源 培养基。图1 不同碳源和氮源粗毛纤孔菌接种7日菌落生长图

表1 不同碳源对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响情况

2.2 不同氮源对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响情况

从图1和表2可以看出，在选用的5种氮源中，除大豆粉培养基没有菌丝生长外，粗毛纤孔菌在其他4种氮源培养基上都能生长，说明粗毛纤孔菌在有机氮源和无机氮源培养基上均能生长，但仍存在较大差异。从本次试验中得出，在相同培养条件下，粗毛纤孔菌在酵母浸粉培养基上菌丝生长势最强(颜色呈奶白色，菌丝边缘生长整齐，菌丝致密)，7日菌落生长面积最大，达1 433.617 mm2，与蛋白胨(439.455 mm2)、牛肉粉(421.839 mm2)、硫酸铵(413.320 mm2)等其他3种氮源相比呈极显著差异。由此得出，在相同培养条件下，适宜粗毛纤孔菌菌丝生长的最佳氮源是酵母浸粉。

表2 不同氮源对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响情况

3 小结与讨论

针对本次试验使用的碳源和氮源，我们在实验室常用的试剂中选择了单糖(葡萄糖、果糖)、双糖(蔗糖、乳糖)、多糖(可溶性淀粉)作为碳源。在碳源单因素试验中，粗毛纤孔菌对果糖的利用成绩最好，这可能与该菌株具有对单糖分解更为快速的酶和途径有关，刘鑫等[20]对寄生枣树的粗毛纤孔菌研究获得相近的结果。在氮源单因素试验中，粗毛纤孔菌对有机氮源的利用结果要好于无机氮源，这可能与有机氮源中营养成分比较全面，从而更有利于粗毛纤孔菌菌丝生长[21-23]有关。在评价菌丝生长势的指标中，菌丝颜色呈现奶白色和浅黄色2种，宋永学等[24]试验得出粗毛纤孔菌母种菌丝颜色在一定程度上可体现菌丝的活力、颜色越浅活力越强的结论，正好与本试验吻合；因此，综合本试验结果得出，适宜粗毛纤孔菌菌丝生长的最佳碳源和最佳氮源分别是果糖和酵母浸粉。

本次试验选用的碳、氮源是实验室常用试剂，为达到试验的客观合理性，每种物质的添加量设计为同一水平，究竟选出的碳、氮源添加的最适量是多少，以及用此制成的母种培养基在进行子实体栽培时是否会出现极好的产量优势，还有待我们今后进一步研究。