金沙藤治疗慢性前列腺炎的潜在靶标及其有效成分预测研究

尚 楠 张凯惠

中国医科大学附属第四医院（辽宁沈阳 110032）

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）是以慢性盆腔疼痛和排尿异常为主要表现的临床综合征[1]。 美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)分类系统将其分类为Ⅲ型前列腺炎， 属泌尿男科门诊常见的疾病之一[2]。 该病在世界范围内发病率约为2.2%～16.0%， 且我国近期的一项针对40 岁以上男性的调查结果显示，高达25.3%的人曾被诊断过CP[3]。 西医学对病因病机的研究存在广泛争议， 治疗上以缓解症状为主要目的，缺乏特异性，治疗效果不甚理想[4]。 金沙藤又名海金沙， 是海金沙科植物Lygodium japonicum(Thunb.)Sw.的干燥成熟孢子， 属多年生蕨类植物，目前收载于2015 年版《中华人民共和国药典》[5]。 《履巉岩本草》、《生草药性备要》、《质问本草》、《草木便方》、《天宝本草》、《广西中药志》、《湖南药物志》 等古今本草专著中记载其具有清利湿热，通淋止痛等功效，被用来治疗慢性前列腺炎[6]。 然而金沙藤中含有的化学成分种类繁多、作用机制复杂，目前尚未有关于其有效成分及作用机制的系统性研究，限制了其进一步的临床应用。 反向药效团搜索是一种小分子靶点预测方法， 该方法将蛋白活性位点进行三维药效团标示， 再将小分子的基团与标示后的药效团进行匹配， 相比传统的反向分子对接方法具有快速高效的特点。 PharmMapper 数据库是基于该方法，以TargetBank、BindingDB、DrugBank 及PDB 等数据库中的23236 个蛋白质为基础， 建立了16159 个药物结合位点药效团模型，对小分子的靶点进行预测[7]。 其快速高效的特点满足了对金沙藤中多种化学成分的靶点预测。 本研究拟通过PharmMapper 数据库预测金沙藤中化学成分的潜在靶点， 并通过富集分析对慢性前列腺炎症相关靶点进行筛选， 最后研究有效成分与其潜在靶点的结合模式及作用机制。

材料与方法

一、材料

金沙藤中的化学成分：海金沙主要含有黄酮类、酚酸类、 糖类及甾体类等， 其中含量较高的主要有田蓟苷，山柰酚，对香豆酸、香叶木苷，香豆酸，原儿茶酸，汉松甾酮，羟基乌苏酸，木栓酮[8]。通过PubChem 数据库搜集上述小分子的化学结构（表1），并利用ChemDraw 软件将化学结构转换成mol2 文件。

表1 海金沙中主要成分的化学结构

二、实验方法

（一）Pharmmapper 数据库预测小分子靶标

将上述mol2 格式的小分子文件上传到Pharmmapper 数据库中，将8 个化合物的mol2 格式文件提交给服务器，生成构象设置为“on”，最大生成构象数设置为300 个。 在高级选项中， 选择药物药效团模型(v2017，16159)作为目标集，其他选项被用作默认值。 最后， 根据小分子药效团与蛋白活性位点药效团的匹配情况，选择Fitscore 前100 的蛋白靶标用于随后的综合网络药理学分析研究。

富集分析：Cytoscape 是一个开源软件平台，用于分子相互作用网络和生物途径的可视化[9]。 我们使用Cytoscape 3.5 版本生成8 个化合物与Pharmmapper 结果之间的相互作用网络， 该网络包含大量的功能节点和联系。 为了对大量的潜在靶点进行生物学解释，我们进一步对目标网络进行GO 和KEGG 富集分析， 以确定金沙藤抗慢性前列腺炎作用的关键途径。

使用cytoscape3.5 中的ClueGO 插件进行KEGG和GO 富集分析[10]。筛选出所有与前列腺炎症相关的途径和靶点。 在ClueGO 操作界面中， 删除重复节点，Go-tree 间期设置为5～10，kappa 评分设置为0.4，P 值阈值设置为0.01，ClueGO 结果仅显示P 值小于或等于0.01 的生物过程和KEGG 通路。

（二）分子对接

通过PDB（https://www.rcsb.org/）网站下载蛋白质3D 结构文件（PDBid：7AFW[11]），并使用MOE 软件对蛋白质进行预处理， 力场设置为Amber10 EHT， 通过Quickprep 模块中的Protonate 3D 功能进行优化， 以便下一步对接。 在对接操作界面中， 将placement 和refinement 分 别 设 置 为 “Triangle Matcher” 和“Induced Fit”， 用London dG 评分评价小分子与蛋白靶标的结合能力。

结 果

一、金沙藤中化学成分的潜在作用靶标

我们将8 个化合物的PharmMapper 结果进行了比对分析。 如表2 所示，结果包含8 个数据集，每个数据集中含有100 个蛋白质。 我们首先对其进行了Venn Diagram 交集研究发现，田蓟苷、山柰酚以及香叶木苷的潜在靶标数据集存在交集； 汉松甾酮C 和乌苏酸的潜在靶标数据集存在交集。 然而没有任何一个蛋白质会同时出现在8 个数据集中。 这说明金沙藤的抗慢性前列腺炎症是通过多重生物学途径实现的。

表2 金沙藤中主要成分的潜在靶标

二、富集分析

为了筛选与慢性前列腺炎症相关的蛋白靶标，我们对800 个蛋白质进行了基于GO 和KEGG 的富集分析。得到一个完整的基因（353 个节点，3133 个联系）富集网络如图1a 所示。 将节点基于中心性测度（Centrality measure）重叠后，图1b 显示了具有关键节点的基因子网络，密切相关的基因项聚集在同一颜色组中。 绿色为免疫应答与信号调节信号通路 （immune response regulation）；蓝色为白细胞分化（leukocyte differentiation）青色的为T 细胞活化（T cell activation）。 上述三个生物学途径的p 值如表3 所示。

图1 潜在靶点的网络药理学研究

表3 潜在靶点参与的关键生物学途径

为了进一步明确8 个化合物中的有效成分， 我们将参与形成上述关键节点的蛋白靶标进行了可视化如图1c， 其中参与免疫信号调节和T 细胞活化途径的蛋白靶标有IL-6、IL-1β、TNF、CCL5 和CTNNB1。 通过比对PharmMapper 结果， 我们得到了小分子与上述蛋白靶标的潜在相互作用关系： 乌苏酸&IL-6、 汉松甾酮C&IL-1β、汉松甾酮C&TNF、山奈酚&CTNNB1、田蓟苷&CTNNB1 以及对香豆酸&CCL5。

讨 论

富集分析结果表明8 个小分子的潜在靶点与免疫应答调节， 白细胞分化以及T 细胞活化等生物途径有着密切的关系。 有研究表明，Th17/Treg 细胞比例失衡是促进慢性前列腺炎发生的重要原因之一，Th17 细胞是 由CD4+T 细 胞 在TCR 激 活 及IL-6，TGF-β，IL-21，IL-1β 和IL-23 等刺激下分化而来，主要受STAT3 信号通路、mTOR 信号通路和HIF1 信号通路调控， 不论抑制上述白介素的功能还是抑制上游信号通路都可以减少 T 细 胞 向 Th17 细 胞 的 转 化[12-14]。 我 们 的PharmMapper 结果显示金沙藤中的有效成分乌苏酸、汉松甾酮能直接与上述细胞因子结合并抑制其功能，进而减少T 细胞向Th17 细胞的转化，达到治疗慢性前列腺炎的作用。 除此之外，山奈酚、田蓟苷、汉松甾酮C 和香豆酸虽然没有直接与上述细胞因子直接作用，但我们的富集分析结果显示，绿色的免疫应答通路与青色的T 细胞活化途径都与慢性前列腺炎相关。 由此推断，它们的潜在靶标与上述调控白介素功能的信号通路关系密切。研究表明，CTNNB1 是STAT3 信号通路的关键调控蛋白，抑制前者的活性可以阻断后者的功能，进而减少细胞因子的分泌达到治疗慢性前列腺炎的作用[15,16]。 这与我们的预测结果完全相符，进一步验证了金沙藤治疗慢性前列腺炎的作用机制。为了进一步确定金沙藤中的有效成分，并探索其与潜在靶标的相互作用机理，我们将参与关键生物途径的蛋白与上述小分子进行了分子对接研究。 如图2 所示，其中田蓟苷&CTNNB1 的分子对接打分最高为-7.8831，其次为乌苏酸&IL-6.8533，远高于其他小分子&蛋白。 说明金沙藤中的有效成分主要为田蓟苷和乌苏酸。二者分别属于黄酮类和甾体类化合物，曾有研究表明这两类化合物对泌尿系统炎症有较好的治疗作用，这也验证了本次筛选结果的准确性。

图2 田蓟苷与CTNNB1 的分子对接构象

在田蓟苷&CTNNB1 的对接构象中， 田蓟苷结合在蛋白活性口袋中， 与氨基酸残基Asn206、Met243 形成氢键相互作用，与H2O506 形成盐桥，进一步稳定了小分子的构象。 研究表明Asn206 是CTNNB1 行驶功能的关键氨基酸，因此我们推断田蓟苷与Asn206 的氢键作用抑制了CTNNB1 功能， 进而影响了T 细胞向Th17 细胞转化，起到治疗慢性前列腺炎的作用。

综上所述， 本研究通过网络药理学确定了金沙藤抗慢性前列腺炎作用的成份与关键途径。 从基因和KEGG 途径中产生了三个与炎症相关的假定途径，然后这些途径中关键激酶的分子对接技术证明田蓟苷和乌苏酸分别以CTNNB1 和IL-6 为靶点，协同作用调节T 细胞向Th17 细胞转化，最终起到治疗慢性前列腺炎的作用。 该方法不仅筛选到了金沙藤中的有效成分，并且对有效成分的作用机制进行了探索研究， 且这种综合方法不仅适用于研究预测多组分中草药的途径或靶点，也适用于多组分中草药配方。