响应面法优化酶解提取绥江苦丁茶香料浸膏的工艺

包秀萍，李锋，刘友杰，李宝志，付祺，朴永革*

1. 云南瑞升烟草技术（集团）有限公司（昆明 650106）；2. 吉林烟草工业有限责任公司（长春 130000）

苦丁茶种类众多，大致分为木樨科、冬青科、金丝桃科、紫草科、马鞭草科。主要分布于西南地区和沿海多雨地区，沿海地区以冬青科苦丁茶最多，西南地区为木樨科的几种女贞苦丁茶[1-6]。云南绥江苦丁茶属于木樨科紫茎女贞，含有丰富的皂甙、萜类、黄酮类物质[7-11]，是上等的绿色健康佳品，其嗅香为清雅茶韵，口感津甜回甘，汤色为明亮的黄绿色。

酶法提取在天然产物提取中应用广泛，在一定条件的水环境中充分破坏植物细胞壁，有效提升植物细胞中的有效组分的溶出，有关报道研究酶解提取冬青科苦丁茶中的熊果酸、酶法提取铁观音中的茶多酚、黄酮等物质[12-24]。但是对绥江紫茎女贞苦丁茶香料浸膏的酶法提取未有报道，通过响应面法优化[25-27]绥江苦丁茶香料浸膏的酶解条件，萃取其萜类等香味成分，并用气相色谱-质谱法[28]对挥发性致香成分进行分析和鉴定，与未经酶解的绥江苦丁茶香料浸膏进行对比分析，为绥江苦丁茶作为香料浸膏的广泛应用提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材料和主要仪器、试剂

绥江苦丁茶（云南省绥江县）。

Agilent 6890N/5975气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；BUCHIR-3000型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；SHZ-D（Ⅲ）。蒸馏萃取装置（自制）。

Viscoflow MG复合植物水解酶[活力80 U/g，诺维信（中国）生物技术有限公司]；乙醇[95%（V/V），食品级，云南汕滇药业有限公司]；无水硫酸钠（AR，广东汕头市西陇化工厂）；二氯甲烷（AR，天津市博迪化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

绥江苦丁茶为原料，酶解时以3倍水（原料质量计）为溶剂，按设计条件进行酶解，并加入10倍95%酒精进行回流提取，旋转蒸发仪减压蒸馏回收溶剂，所得样品为绥江苦丁茶香料浸膏。

1.2.2 响应面法试验设计

因素水平提取工艺设计：根据有关资料和预备单因素试验，以酶解温度、酶解时间和酶解pH为主要影响因素，以测得绥江苦丁茶香料浸膏样品得率为考察指标，利用响应面法的Box-Behnken Design设计，每个因素取3个水平，以-1，0和+1编码，以苦丁茶的萃取率为响应值进行萃取工艺因素水平设计（表1）。

表1 试验因素水平编码

萃取率按式（1）计算。

1.2.3 GC-MS分析条件

1.2.3.1 色谱条件

TR-5MS，60 m×0.25 mm×0.25 μm；载气，氦气（99.999%）；进样量1 mL；分流比15∶1；柱流速，恒流0.8 mL/min。程序升温：初始温度80 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速率升至240 ℃，保持30 min。传输线温度250 ℃；进样口温度250 ℃。

1.2.3.2 质谱条件

EI能量70 eV，溶剂延迟6 min，扫描离子范围50～650 amu。定性分析采用NIST08质谱谱库检索；定量分析采用归一化法。

2 结果与讨论

2.1 响应面试验结果及分析

2.1.1 响应面试验结果

按照响应面法的Box-Behnken Design的试验方案进行3因素3水平试验，结果见表2。

表2 试验设计及结果

试验方案的15个试验点中包括12个析因点（1～12）及3个中心点（13～15），以绥江苦丁茶香料浸膏的萃取率Y作为响应面分析的响应值。

2.1.2 响应面试验结果分析

对表2试验数据进行多元回归拟合，得到绥江苦丁茶香料浸膏萃取率（Y）对酶解温度（A）、酶解pH（B）和酶解时间（C）的二次多项回归方程模型为：Y=-299.058 33+6.312 08A+54.120 83B+0.878 611C+ 0.255 000AB-0.003 083AC-0.005 833BC-0.068 333A2- 6.183 33B2-0.005 565C2。

该二次回归方程方差分析结果和回归方程系数显著性检验结果见表3。3因素交互作用对绥江苦丁茶香料浸膏萃取率的响应面分析结果见图1～图6。

表3 回归方程模型的方差分析结果

由表3数据和图1～图6可以看出，该模型统计学意义上差异极显著（p＜0.01），失拟项不显著，说明没有未知因素对试验结果干扰。模型的决定系数R2为0.990 7，修正决定系数R2为0.974 1，大于0.9，说明模型能解释绥江苦丁茶香料浸膏萃取率响应值的变化。该模型与实际情况拟合较好，可用于分析和预测酶解萃取绥江苦丁茶的实际情况。

图1 酶解温度-酶解pH对萃取率的等高线图

图6 酶解pH-酶解时间对萃取率的响应面分析

图2 酶解温度-酶解pH对萃取率的响应面分析

图3 酶解温度-酶解时间对萃取率的等高线图

图4 酶解温度-酶解时间对萃取率的响应面分析

图5 酶解pH-酶解时间对萃取率的等高线图

由表3可知，一次项A和B差异极显著（p＜0.01），C差异不显著（p＜0.01）。说明酶解温度和pH对绥江苦丁茶香料浸膏萃取率有极显著影响，而酶解时间影响不显著。二次项A2、B2和C2均极显著水平（p＜ 0.01）。A和B交互项差异也是极显著（p＜0.01），说明这2个因素交互作用对绥江苦丁茶香料浸膏萃取率有极显著影响。

2.1.3 验证试验

为进一步验证该模型与测定的可靠性，对方程最优条件（酶解温度53.57 ℃、酶解pH 5.32和酶解时间61.33 min）进行3次试验（为方便操作，实际采用酶解温度53 ℃、酶解pH 5.3和酶解时间60 min），绥江苦丁茶香料浸膏萃取率的平均值为40.45%，与通过Design Expert软件优化后的回归方程求解得到的预测值40.94%接近，这说明该模型较可靠，响应面法适用于对绥江苦丁茶香料浸膏的酶解萃取工艺进行回归分析和参数优化。

2.2 绥江苦丁茶香料浸膏样品的挥发性成分分析

通过酶解提取苦丁茶香料浸膏，能够有效提高苦丁茶浸膏萃取率，与未酶解的苦丁茶香料浸膏对比，主要有效成分含量显著提升，其挥发性成分总离子流图见图7。

图7 绥江苦丁茶香料浸膏挥发性成分的总离子流图

据表4可知，经酶解提取的绥江苦丁茶香料浸膏的挥发性成分共鉴定出化合物51种，与未经酶解提取的绥江苦丁茶香料浸膏（32种化合物）对比，多了19种成分，且苦丁茶中的主要化合物芳樟醇、α-松油醇、香叶醇、橙花醇、脂肪酸酯类等含量明显高于未经酶解的苦丁茶香料浸膏，说明酶解能够充分破坏苦丁茶细胞壁，利于苦丁茶细胞组织中的成分高效溶出，提高苦丁茶浸膏的萃取率，且提升苦丁茶中的主要挥发性化合物的含量。

表4 绥江苦丁茶香料浸膏挥发性化学成分 单位：μg/g

3 结论

绥江苦丁茶香料浸膏酶解提取工艺的最佳组合实际采用酶解温度53 ℃、酶解pH 5.3和酶解时间60 min，进行验证说明结果可靠。

挥发性成分分析结果表明：绥江苦丁茶香料浸膏中含有大量的致香成份，如芳樟醇、α-松油醇、香叶醇、橙花醇、脂肪酸酯类等物质，与未酶解的绥江苦丁茶香料浸膏挥发性成分对比，经过酶解提取工艺制备的绥江苦丁茶香料浸膏中的主要挥发性成分含量较未酶解的高2倍以上。除此之外，酶解提取还能够充分溶出绥江苦丁茶中大量挥发性物质，有效增加绥江苦丁茶香料浸膏挥发性物质的丰富性，具有显著的清雅茶香气和香味，是一种高品质的香料浸膏。为提升绥江苦丁茶原料和绥江苦丁茶香料浸膏的利用奠定基础。