微小RNA-508-3p靶向调控配对盒基因2影响肺癌细胞生物学特性的分子机制研究

张吉炯, 张 健

(湖北省黄石市中心医院普爱院区, 湖北 黄石, 435000)

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，主要治疗途径为外科手术、放疗、化疗及生物靶向治疗，但治疗后易复发或转移，患者5年生存率低、病死率高(主要原因为肿瘤的持续增殖及转移)[1-2]。因此，研究肺癌的分子机制并寻找新的治疗靶点具有重要意义。微小RNA(miRNA)是高度保守的小型非编码RNA，长度为20～25个核苷酸，其可通过与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)互补结合而沉默靶基因的表达，导致mRNA被降解或翻译被抑制，与癌症的发生发展有关[3]。微小RNA-508-3p(miR-508-3p)在胃癌[4]、卵巢癌[5]中表达下调并发挥肿瘤抑制功能，但其在肺癌中的作用尚不明确。配对盒基因2(PAX2)是PAX转录因子家族成员之一，在食管癌、前列腺癌等多种肿瘤中表达升高，可促进肿瘤细胞生长，参与肿瘤的发生发展[6]。研究[7]报道,PAX2在肺癌中表达升高，且淋巴结转移组PAX2表达高于非淋巴结转移组，提示PAX2可能影响肺癌细胞生长。小干扰RNA(siRNA)是近年来研究基因沉默的重要工具，可特异性抑制相应靶基因mRNA表达，进而降解靶基因，也称为转录后调控，目前已被广泛应用于肿瘤治疗、基因功能研究等多方面[8-9]。本研究检测肺癌组织miR-508-3p、PAX2表达水平，探讨miR-508-3p对肺癌细胞增殖活力、侵袭能力、凋亡的影响及对PAX2的调控作用与机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本及细胞

收集2018年6月—2019年3月本院胸外科手术切除的肺癌组织标本，同时收集相应的癌旁组织(距离肿瘤边缘1～3 cm)为对照，标本共来自43例患者，其中男20例、女23例，年龄36～70岁，平均58.4岁。所有患者经病理学检查确认病理类型为腺癌，且均为首次治疗，术前未接受放疗、化疗及其他抗癌治疗。所有组织标本经手术切除后置于液氮罐中保存备用。本研究已获得患者知情同意，并经医院伦理委员会审核批准。人肺腺癌A549细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

1.2 主要试剂和仪器

胎牛血清(FBS)及RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司; PAX2、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体均购自美国Abcam公司; 二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自中国碧云天公司; 聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自上海生工生物工程有限公司; 噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司; 蛋白质印迹法(Western blotting)细胞裂解液购自美国Promega公司; Transwell小室购自美国corning costar公司; 细胞凋亡试剂盒及流式细胞仪均购自美国BD公司; 酶标仪购自美国Biotek公司; CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司。

1.3 细胞培养及转染

取出保存在液氮罐中的A549细胞，迅速解冻后在CO2体积分数为5%、37 ℃细胞培养箱中，用含10%FBS的RPMI1640培养基培养细胞。取对数生长期细胞，转染前1 d, 接种细胞于24孔细胞培养板，接种密度为3×104个/mL, 用含10% FBS的RPMI1640培养基培养，次日，观察到细胞贴壁，且生长密度达60%～70%时，使用Opti-MEM培养基分别稀释si-PAX2(转染PAX2特异性siRNA，si-PAX2组)、si-NC(转染阴性对照siRNA, si-NC组)和转染试剂，设置加脂质体的为空白组, 5 min内将siRNA与转染试剂混合，室温静置20 min, 将混合液加入培养板相应孔内，将细胞置于培养箱内常规培养, 6～8 h后，将转染液弃去，加含10% FBS的RPMI1640培养基培养。具体操作步骤参照美国Invitrogen生产的Lipofectamie 2 000转染试剂的操作说明。同法转染miR-508-3p(转染miR-508-3p模拟物, miR-508-3p组)、miR-NC(转染模拟物阴性对照miR-NC，miR-NC组)、anti-miR-508-3p(转染miR-508-3p抑制剂, anti-miR-508-3p组)、anti-miR-NC(转染抑制剂阴性对照anti-miR-NC，anti-miR-NC组)、miR-508-3p+pcDNA-PAX2(共转染miR-508-3p和PAX2过表达质粒pcDNA-PAX2, miR-508-3p+pcDNA-PAX2组)、miR-508-3p+pcDNA-NC(共转染miR-508-3p和空白质粒pcDNA-NC，miR-508-3p+pcDNA-NC组)。48 h后采用定量聚合酶链反应(qPCR)法或Western blotting检测转染后的细胞miR-508-3p或PAX2表达。

1.4 qPCR检测miR-508-3p、PAX2 mRNA表达

根据制造商的规程，使用TRIzol试剂提取组织或细胞总RNA。使用PrimeScript RT Reagent Kit合成互补DNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix在ABI 7500系统上进行qPCR反应。使用的引物序列如下: miR-508-3p正向5′-CAAGCATGATTGTAGCCTTTTG-3′, 反向5′-TATC

GTTGTACTCCAGACCAAGAC-3′; U6小核RNA(snRNA)正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PAX2正向5′-CCTGGCCACACCATTGTTC-3′, 反向5′-TCACGTTTCCTCTTCTCACCAT-3′; GAPDH正向5′-CTCAAGATCATCAGCAATGCC-3′, 反向5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGATAC-3′。使用2-ΔΔCt方法，以U6 snRNA和GAPDH作为内部对照分析miR-508-3p、PAX2mRNA相对表达水平。

1.5 Western blotting检测蛋白表达

采用蛋白提取试剂盒提取组织或细胞总蛋白，以BCA法定量蛋白，蛋白于100 ℃变性8 min, 每孔道上样等量蛋白，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 电泳结束后将蛋白转膜至PVDF膜，膜置于5%脱脂奶粉溶液中封闭，室温摇床上慢摇1.5 h, 根据预染marker将PVDF膜含PAX2、MMP-2、Bcl-2和Bax的部分依次剪下，放入一抗溶液中(稀释倍数1∶1 000), 4 ℃孵育过夜, TBST缓冲液洗膜，随后于二抗溶液中室温孵育45 min, 洗膜，电化学发光(ECL)显影，曝光拍照。用ImageJ软件定量强度，内参为GAPDH。实验重复3次。

1.6 MTT法检测细胞增殖活力

胰酶消化对数生长期A549细胞，制备成细胞悬液，并调整浓度为1×104个/mL, 按照5×103个/孔接种细胞于96孔板，每孔加100 μL, 每个样本设置5个平行孔，于培养48 h吸掉培养液，每孔中加10 μL MTT溶液，温育4 h, 中加150 μL DMSO, 平板摇床上摇匀后，采用酶标仪于490 nm处测定光密度(OD)值。

1.7 Transwell小室检测细胞侵袭能力

将Transwell小室置于24孔板内，向每孔中加100 μL已配置好的基质胶工作液，来回晃动培养板，及时将气泡去除，使基质胶均匀包被在小室的上室，于培养箱中常规培养1 h。用胰酶消化经si-PAX2处理48 h的A549细胞，制备成单细胞悬液，计数。小室上室中加300 μL细胞悬液(5×105个细胞)，相应的每孔下室中加600 μL含FBS的完全培养基，然后放入培养箱中常规培养。24 h后，取出Transwell小室，使用棉签轻轻擦掉上室内细胞、液体及基质胶。用甲醇固定, 0.1%结晶紫染色, 15～20 min后，用PBS缓冲液将多余结晶紫洗去，风干。倒置显微镜下观察小室外底膜上染色后呈现的阳性细胞，拍照。显微镜下随机选择5个视野，取均值，实验重复3次。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡率

以1×105个/孔密度接种对数生长期A549细胞于6孔细胞培养板中, 24 h吸弃原有培养基，转染si-PAX2, 48 h后，用胰酶消化细胞，消化终止后将细胞转移至流式管，离心，收集细胞。加500 μL结合缓冲液重悬细胞，然后加5 μL 碘化丙啶(PI), 混匀，再加入5 μL 膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC), 混匀，室温避光孵育15 min, 以流式细胞术仪检测分析。实验重复3次。

1.9 双荧光素酶活性检测

分别构建含有miR-508-3p结合位点的PAX2-3′UTR-野生型(WT)及突变型(MUT)报告基因载体，在A549细胞中转染miR-508-3p和PAX2-3′UTR-WT及MUT报告基因载体。48 h后收集细胞采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

1.10 统计学分析

2 结 果

2.1 肺癌组织中miR-508-3p、PAX2mRNA、PAX2蛋白表达水平和相关性分析

与癌旁组织比较，肺癌组织中miR-508-3p相对表达水平降低,PAX2mRNA相对表达水平和PAX2蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05); PAX2蛋白表达水平与miR-508-3p表达水平呈显著负相关(P<0.05)。见图1。

A: miR-508-3p相对表达水平柱状图; B: PAX2 mRNA相对表达水平柱状图; C: PAX2蛋白表达水平柱状图; D: PAX2蛋白Western blotting条带图; E: PAX2蛋白与miR-508-3p的相关性分析图。与癌旁组织比较, ∗P<0.05。图1 miR-508-3p、PAX2 mRNA、PAX2蛋白表达水平和相关性分析

2.2 转染miR-508-3p对肺癌A549细胞增殖活力、侵袭能力和细胞凋亡的影响

与空白组比较, miR-508-3p组miR-508-3p、Bax表达水平和细胞凋亡率均升高, MMP-2、Bcl-2蛋白表达水平和增殖活力(OD值)、侵袭能力均降低，差异有统计学意义(P<0.05); miR-NC组与空白组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。由此提示，转染miR-508-3p可抑制肺癌A549细胞增殖活力和侵袭能力，诱导细胞凋亡。见图2、表1。

2.3 si-PAX2对肺癌A549细胞增殖活力、侵袭能力和细胞凋亡的影响

与si-NC组比较, si-PAX2组PAX2、MMP-2、Bcl-2表达水平降低, Bax表达水平、凋亡率升高，增殖活力和侵袭能力降低，差异有统计学意义(P<0.05), 提示使用设计合成的PAX2特异性siRNA转染48 h, 可抑制肺癌A549细胞增殖活力和侵袭能力，诱导细胞凋亡。见图3、表2。

2.4 miR-508-3p对PAX2的靶向调控作用

Starbase预测结果显示, miR-508-3p含有PAX2的互补序列，见图4A。双荧光素酶活性检测和Western blotting检测结果显示，与miR-NC组比较, miR-508-3p组转染PAX2-3′UTR-WT的A549细胞荧光素酶活性降低, PAX2表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05); miR-508-3p组转染PAX2-3′UTR-MUT的A549细胞荧光素酶活性与miR-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05); anti-miR-508-3p组PAX2表达水平高于anti-miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4B、表3、表4。由此提示, miR-508-3p可靶向PAX2基因，调控PAX2蛋白表达水平。

2.5 PAX2逆转miR-508-3p对肺癌A549细胞增殖活力、侵袭能力、细胞凋亡的影响

与miR-508-3p+pcDNA-NC组比较, miR-508-3p+pcDNA-PAX2组PAX2、MMP-2、Bcl-2表达水平升高, Bax表达水平、细胞凋亡率降低，增殖活力和侵袭能力升高，差异均有统计学意义(P<0.05), 表明PAX2可以逆转miR-508-3p对肺癌A549细胞增殖活力、侵袭能力及细胞凋亡的影响。见图5、表5。

A: 3组miR-508-3p相对表达水平(与空白组比较, ∗P<0.05); B: 3组细胞凋亡情况的流式细胞仪检测结果; C: 3组细胞侵袭情况的Transwell检测结果; D: 3组MMP-2、Bcl-2和Bax蛋白Western blotting条带图。图2 转染miR-508-3p对肺癌A549细胞增殖活力、侵袭能力、细胞凋亡的影响

表1 空白组、miR-NC组、miR-508-3p组蛋白表达、细胞增殖活力、侵袭能力和细胞凋亡结果比较

A: 2组细胞凋亡情况的流式细胞仪检测结果; B: 2组细胞侵袭情况的Transwell检测结果; C: 2组PAX2、MMP-2、Bcl-2和Bax蛋白Western blotting条带图。图3 si-PAX2对肺癌A549细胞侵袭能力和蛋白表达的影响

表2 si-NC组、si-PAX2组蛋白表达、细胞增殖活力、侵袭能力和细胞凋亡结果比较

A: PAX2与miR-508-3p结合的starbase预测图; B: 4组PAX2蛋白Western blotting条带图。图4 miR-508-3p靶向调控PAX2的预测图和PAX2蛋白表达水平

表3 miR-NC组、miR-508-3p组双荧光素酶活性检测结果

表4 4组PAX2蛋白表达水平比较

3 讨 论

miR-508-3p是多种肿瘤的重要调节因子，研究[10]报道, miR-508-3p模拟物可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭。miR-508-3p在三阴性乳腺癌组织和细胞中表达显著降低，miR-508-3p过表达通过上调锌指E-盒结合同源异形盒-1(ZEB1)显著抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭能力[11]。本研究结果发现, miR-508-3p在肺癌中同样低表达，其过表达具有抑制肺癌细胞增殖、侵袭以及促进凋亡的作用，提示miR-508-3p作为肺癌的肿瘤抑制因子参与肺癌进展。

A: 2组细胞凋亡的流式细胞仪检测结果; B: 2组细胞侵袭数量的Transwell检测结果; C: 2组PAX2、MMP-2、Bcl-2和Bax蛋白Western blotting条带图。图5 2组细胞凋亡、侵袭能力和蛋白表达结果

表5 2组蛋白表达、细胞增殖活力、侵袭能力及细胞凋亡情况比较

研究[12]显示, miRNA通过靶向靶mRNA发挥细胞功能。本研究发现，肺癌组织中PAX2蛋白表达与miR-508-3p呈显著负相关，且Starbase生物信息预测结果和双荧光素酶报告实验确定PAX2为miR-508-3p的下游靶基因，且miR-508-3p负调控PAX2蛋白表达。PAX2定位于人类10号染色体q24-25上，是一种重要的转录因子，在发育成熟组织中，异常表达的PAX2可呈现致癌作用[13-14]。近年来，相关研究[15-16]报道了PAX2在卵巢癌、急性髓性白血病等疾病中的表达水平，并发现PAX2在不同肿瘤中可能发挥不同作用。本研究收集43例患者的肺癌组织标本，采用Western blotting检测组织中PAX2表达，结果显示肺癌组织中PAX2表达水平显著高于癌旁组织，与既往研究[4]结论一致。张丽萍等[17]研究显示，用PAX2siRNA转染子宫内膜癌HEC-1A细胞，可明显抑制癌细胞增殖，促进细胞凋亡。UEDA T等[18]研究显示, PAX2可通过对HGF的转录调控而增强前列腺癌细胞的侵袭能力。由此推测，抑制PAX2表达或可影响肺癌细胞生长。本研究用设计合成的PAX2特异性siRNA转染肺癌A549细胞，转染后的细胞PAX2表达水平显著降低，进一步行生物学特性研究发现, PAX2表达被抑制后的A549细胞增殖能力和侵袭能力均显著降低，凋亡率显著升高。本研究还发现,PAX2可以逆转miR-508-3p对A549细胞增殖活力、侵袭能力以及细胞凋亡的影响，提示miR-508-3p对肺癌细胞的抑制作用与下调PAX2表达有关。

基质金属蛋白酶(MMP)是一个大家族，几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，在肿瘤侵袭及转录过程中发挥着关键性作用[19-20]。MMP-2为MMP家族成员之一，是肿瘤侵袭转移的标志分子，多项研究[21-22]表明，抑制MMP-2表达可降低肺癌细胞侵袭和转移能力，但PAX2能否通过调节MMP-2影响肺癌细胞侵袭能力尚未明确。在细胞凋亡过程中, Bcl-2和Bax分别发挥抑凋亡作用和促凋亡作用，两者可形成同源二聚体(Bcl-2/Bcl-2, Bax/Bax)或异源二聚体(Bcl-2/Bax), 从而促进或抑制细胞凋亡, Bcl-2和Bax是细胞死亡的关键调节因素[23-24]。多项研究[25-26]表明，调节肺癌细胞Bcl-2和Bax表达可影响癌细胞凋亡。本研究用miR-508-3p模拟物或PAX2特异性siRNA转染肺癌A549细胞后，采用Western blotting检测MMP-2、Bcl-2和Bax表达，结果显示, MMP-2和Bcl-2表达降低, Bax表达升高。由此提示，过表达miR-508-3p或抑制PAX2表达可通过下调MMP-2、Bcl-2表达和上调Bax表达影响肺癌细胞侵袭能力和凋亡。

综上所述, miR-508-3p在肺癌组织中低表达,PAX2在肺癌组织中高表达，过表达miR-508-3p通过靶向抑制肺癌A549细胞PAX2表达而降低细胞增殖和侵袭能力，诱导细胞凋亡，提示miR-508-3p和PAX2可能是肺癌治疗的潜在靶标。