扶正消积汤对小鼠肺癌模型肿瘤的生长抑制及免疫功能的改善研究

赵 磊, 李 慧, 潘景仁, 王旦辉, 江 勤, 肖 璐

(1. 新疆医科大学校医院, 新疆 乌鲁木齐, 830011;2. 新疆医科大学第二附属医院 中医科, 新疆 乌鲁木齐, 830028;3. 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市妇幼保健院 中医科, 新疆 乌鲁木齐, 830000)

非小细胞肺癌是人类常见恶性肿瘤之一，患者往往预后不良[1]。当人体处于免疫抑制状态时，肿瘤会出现“免疫逃逸”[2]。近年来，中药已被越来越多地应用于抗肿瘤治疗中，扶正消积汤作为临床常用方剂，可增强化疗药物的抗肿瘤作用[3-4]。研究[5]发现，扶正消积汤可改善结肠癌患者的免疫力。但关于扶正消积汤能否通过调控免疫功能抑制肺癌肿瘤的生长，目前尚不明确。本研究构建肺癌LA-4细胞荷瘤小鼠模型，探讨扶正消积汤对荷瘤小鼠肿瘤生长、免疫调节的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株与动物

鼠肺癌细胞株LA-4(北京中科院细胞库); 无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠30只，雄性, 6～8周龄，体质量17～23 g, 购自武汉汉生生物有限公司，动物许可证编号为SYXK(浙)2021-0017, 动物防疫合格证编号为(汉)动防合字第20200031号。饲养条件: 温度21～25 ℃, 湿度40%～70%, 自由活动，正常饲养。动物实验符合“3R”原则[6]。

1.2 中药制备方法

扶正消积汤组方为党参15 g、黄芪15 g、茯苓12 g、白术20 g、陈皮15 g、苡仁30 g、仙鹤草30 g、白花蛇舌草30 g、炙甘草10 g。清洗药材，煎煮后过滤, 60～80 ℃隔水蒸，浓缩成生药量1 g/mL, 4 ℃储存。

1.3 仪器与试剂

鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(XY-SJH-N1027, XY-SJH-N1123, 苏州金唯智生物有限公司)检测，兔抗鼠CD3、CD4、CD8抗体(ab1535, ab1624, ab1811, Abcam, 美国), BD FACSCanto Ⅱ分析型流式细胞仪(天津仪器厂), JD-SY96S全自动多功能酶标仪(天津仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 肺癌荷瘤小鼠模型建立: DMEM培养基(10%胎牛血清、10万U/L青霉素、100 mg/L链霉素)培养细胞，条件37 ℃、5%CO2饱和湿度, 24 h换液。制备1×106/mL细胞悬液。在24只小鼠右侧前肢腋下消毒后注射0.2 mL, 10 d后见皮下约5 mm的肿瘤表明模型构建成功[7]。

1.4.2 处理及分组: 将24只荷瘤小鼠随机分为4组，即模型组(同剂量生理盐水灌胃)、低剂量组(125 mg/kg扶正消积汤灌胃)、中剂量组(250 mg/kg扶正消积汤灌胃)、高剂量组(500 mg/kg扶正消积汤灌胃)，每组6只,1次/d, 共28 d。将6只正常小鼠设为对照组，给予等量生理盐水(量同低剂量组)灌胃, 1次/d, 共28 d。每4 d测量荷瘤小鼠肿瘤长径(a)和短径(b), 根据V=ab2/2计算肿瘤体积。

1.4.3 胸腺指数、脾脏指数及抑瘤率: 最后一次给药后24 h, 断颈法处死小鼠，剥离瘤体、脾脏、胸腺，计算抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数。抑瘤率=(1-给药组瘤质量/模型组瘤质量)×100%; 胸腺指数=胸腺质量(mg)/小鼠体质量(g); 脾脏指数=脾脏质量(mg)/小鼠体质量(g)。

1.4.4 流式细胞术检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群水平: 各组小鼠最后一次给药后24 h摘除眼球取血，加入红细胞裂解液，离心(1 000转/min, 离心半径10 cm, 10 min), 去上清，重悬，加入CD3、CD4和CD8一抗(1∶200、1∶200、1∶100), 室温避光孵育15 min, 上机检测CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比，并计算CD4+/CD8+值。

1.4.5 小鼠血清TNF-α、IL-2表达水平检测: 采用ELISA法检测TNF-α、IL-2水平。

1.4.6 淋巴细胞转化及特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性测定: 制备脾脏单细胞悬液，裂解红细胞，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤，按照4×105/mL密度接种96孔板, 5 μg/mL的ConA孵育72 h后测量570 nm处光密度(OD)值。制备的小鼠脾细胞为效应细胞，对数生长期LA-4细胞为靶细胞，相同数量细胞共培养24 h后测量490 nm处OD值。计算CTL杀伤活性，公式为[1-(实验孔OD-效应细胞对照孔OD)/靶细胞对照孔OD]×100%。每组5个复孔。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 扶正消积汤对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

给药第20、24、28天，不同剂量扶正消积汤组小鼠肿瘤体积均小于模型组，且高剂量组小鼠肿瘤体积小于低剂量组、中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。不同剂量扶正消积汤组小鼠的肿瘤质量低于模型组，抑瘤率高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05); 高剂量组的肿瘤质量低于低剂量组、中剂量组，抑瘤率高于低剂量组、中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。低剂量组小鼠的肿瘤体积、质量及抑瘤率与中剂量组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

A: 4组荷瘤小鼠肿瘤体积比较(与模型组比较, *P<0.05; 与高剂量组比较, #P<0.05);

表1 4组荷瘤小鼠肿瘤质量和抑瘤率比较

2.2 扶正消积汤对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响

模型组小鼠脾脏指数、胸腺指数低于对照组，中剂量组、高剂量组脾脏指数、胸腺指数高于模型组，高剂量组脾脏指数、胸腺指数高于低剂量组、中剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05); 低剂量组脾脏指数、胸腺指数与模型组比较，低剂量组脾脏指数、胸腺指数与中剂量组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠免疫器官指数比较 mg/g

2.3 扶正消积汤对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响

模型组小鼠外周血CD4+T细胞水平、CD4+/CD8+值低于对照组, CD8+T细胞水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 中剂量组、高剂量组CD4+T细胞水平、CD4+/CD8+值高于模型组, CD8+T细胞水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05), 而低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05); 低剂量组、中剂量组CD4+T细胞水平、CD4+/CD8+值低于高剂量组, CD8+T细胞水平高于高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量组T淋巴细胞亚群水平与中剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图2。

2.4 扶正消积汤对荷瘤小鼠淋巴细胞转化及CTL杀伤活性的影响

模型组小鼠淋巴细胞转化及CTL杀伤活性均低于对照组，中剂量组、高剂量组则高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05), 而低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05); 低剂量组、中剂量组小鼠淋巴细胞转化及CTL杀伤活性均低于高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05), 而低剂量组与中剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表3 各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群水平比较

图2 流式细胞术检测各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群水平

表4 各组小鼠淋巴细胞转化及CTL杀伤活性比较

2.5 扶正消积汤对荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平的影响

模型组小鼠血清TNF-α、IL-2水平均低于对照组，中剂量组、高剂量组血清TNF-α、IL-2水平均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05), 而低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05); 低剂量组、中剂量组小鼠血清TNF-α、IL-2水平均低于高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05), 而低剂量组与中剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 各组小鼠血清TNF-α、IL-2水平比较 pg/mL

3 讨 论

中医理论[8-10]认为，肺癌病因为气血不通、痰毒凝聚，治疗原则以扶正为主，消瘀化痰为辅。扶正消积汤中的白术、黄芪可起到扶正益气功能，甘草、石斛可生津滋阴，三七、仙鹤草具有清热解毒、补虚亏及抑癌散瘀功能，鸡内金可健脾消积，猪苓、薏苡仁可化浊抑癌[11-16]。临床研究[17-18]表明，扶正消积汤可改善肿瘤患者的临床症状。研究[19]发现，扶正消积汤可抑制人肺腺癌SPC-A1细胞增殖，促进凋亡。本研究发现，扶正消积汤可抑制肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长，且抑制作用呈浓度依赖性。

恶性肿瘤患者存在免疫功能低下的情况，胸腺、脾脏是人体最重要的免疫器官，其质量的改变可反映人体的免疫功能[20]。本研究结果显示，中剂量、高剂量扶正消积汤治疗可显著升高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，提示扶正消积汤可增强荷瘤小鼠的免疫功能。淋巴细胞体外转化是评估淋巴细胞功能的指标之一。CTL作为重要的效应细胞，其杀伤活性是评价机体细胞免疫功能的重要指标，也是评价药物对免疫系统影响的重要方法[21]。本研究结果显示，与模型组比较，中剂量组、高剂量组小鼠淋巴细胞转化程度及CTL杀伤活性均显著升高。由此表明，扶正消积汤可通过增加免疫器官质量、提高淋巴细胞转化程度以及增强CTL杀伤活性而改善荷瘤小鼠免疫功能。

T淋巴细胞在人体抗肿瘤免疫中发挥重要作用，其中CD4+T淋巴细胞分泌 TNF-α、IL-2 等细胞因子，提高人体免疫应答, CD8+T淋巴细胞则起到负向调控作用。CD4+/CD8+值下降，提示人体免疫功能处于抑制状态[22]。临床研究[23-24]发现，肺癌患者机体存在免疫功能抑制情况，如CD4+T淋巴细胞减少, CD8+T淋巴细胞增多, CD4+/CD8+值显著降低。本研究结果显示，中剂量、高剂量扶正消积汤治疗可提高荷瘤小鼠CD4+T细胞水平，降低CD8+T细胞水平，并提高CD4+/CD8+值。TNF-α、IL-2等细胞因子在肿瘤发生发展及免疫治疗中起着至关重要的作用。本研究发现，中剂量、高剂量扶正消积汤还可提高荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平，提示扶正消积汤可能通过促进TNF-α、IL-2等细胞因子的分泌，活化T细胞，提高免疫功能，进而起到抗肿瘤的作用。

综上所述，扶正消积汤可抑制肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长，改善荷瘤小鼠免疫功能，促进CD8+T细胞分泌IL-2、TNF-α。然而，扶正消积汤含有多种药物成分，其具体机制有待进一步研究证实。