山羊DGAT1基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

杨昌恒，李 琪，黄 维，林亚秋，王 永，向 华*，朱江江*

(1.西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041； 2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室， 成都 610041)

山羊肉是一种高营养肉类，具有高蛋白质、低胆固醇等特点，然而目前山羊肉的品质限制了其产业发展。动物肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)含量是影响肉质风味、嫩度的重要因素之一，适当提高IMF可改善肉质和口感[1-3]。甘油三酯(triacylglyce-rol, TAG)含量与IMF密切相关，脂质的沉积主要受到甘油三酯的合成和分解代谢两个方面的影响。一方面，甘油三酯的合成是从3磷酸甘油的sn-1位点优先被酯化开始的，这一过程可由线粒体3-磷酸甘油酰基转移酶 (glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAM)催化[4]。之后，磷酸甘油酰基转移酶6 (1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferases, AGPAT6) 催化sn-2位点的酯化[5]，最后，二酰甘油酰基转移酶1(acyl CoA:diacylglycerol acyltransferase 1, DGAT1)催化TAG合成最后一步反应。新合成的甘油三酯被存储在脂滴中，而47 ku尾部相互作用蛋白(tail-interacting protein 47, TIP47)和脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation-related protein, ADRP)则是胞内脂滴形成的关键调控蛋白[6]。另一方面，甘油三酯的分解代谢则主要在甘油三酯水解酶 (adipose triglyceride lipase, ATGL)和激素敏感脂酶 (hormone-sensitive lipase, HSL)的催化作用下实现的[7-8]，分别催化了甘油三酯和甘油二酯(diacylglycerol, DAG)的水解，最终导致甘油一酯和游离脂肪酸的释放[9]。

DGATs作为机体甘油三酯合成的关键酶，可催化甘油二酯和脂肪酸最终形成甘油三酯，其最早是在鸡肝中被发现的[10]，分为DGAT1和DGAT2两种类型。Cases等[11]在1998年首次从小鼠中克隆得到DGAT1基因，并陆续在人[12]、牛[13]、猪[14]等物种中发现。DGAT1在动物体内表达广泛，在乳腺、皮肤、小肠、睾丸和脂肪组织中表达量较高[11]，且在组织中的表达量与TAG的代谢作用相关[15]。Chen等[16]发现，在FVB小鼠脂肪组织中过表达人DGAT1基因后，脂肪组织中的TAG合成量显著增加。Yu等[17]研究发现，敲除DGAT1可抑制饮食引起的小鼠血浆三酰甘油升高，并抑制高脂饮食后脂质的吸收[18]。过表达DGAT1可增加肝极低密度脂蛋白(VLDL)微粒的分泌和促进大脂滴的形成[19]，并增加甘油三酯的沉积[20]，同时促进DAG摄取和骨骼肌IMF的沉积[21-22]。而DGAT1活性缺失则会抑制小鼠心脏甘油三酯的合成和代谢途径[23]。在反刍动物中，干扰DGAT1的表达可显著降低牛乳腺上皮细胞中的甘油三酯含量[24]。其中，DGAT1基因K232A突变中K等位基因能提高牛奶产量和乳脂率[25-26]。Sun等[27]发现，丙酸和丁酸盐处理山羊乳腺上皮细胞均可上调DGAT1的表达，并促使山羊乳脂中三酰甘油和脂滴合成量的增加。可见，DGAT1对机体甘油三酯合成和代谢起到关键作用，深入研究DGAT1的功能对进一步揭示机体脂质代谢调控的分子机制具有重要意义。然而，关于DGAT1在调控山羊肌内脂肪沉积中的作用及其分子机制还不清楚，而基因序列的缺失严重影响了对其功能的进一步研究。

本研究以我国第二个肉用山羊培育品种—简州大耳羊为研究对象，克隆DGAT1基因序列，探讨其在 不同组织中的表达水平，利用生物信息学等方法预测其功能，并进一步在山羊肌内前体脂肪细胞中初步验证其功能。这些结果将为进一步揭示DGAT1在调控山羊IMF形成中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年在西南民族大学青藏高原研究院完成。从四川省简阳市大哥大牧业有限公司随机选取7只健康的10月龄简州大耳公羊，在实验室清晨空腹屠宰，经DEPC处理水洗净后，立即采集心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、股二头肌、臂三头肌、大肠、小肠组织样本，洗净分装后冻存至液氮罐中。

主要试剂：反转录试剂盒、TRIzol试剂、限制性内切酶Hind Ⅲ与BamH Ⅰ购自大连TaKaRa公司；DH5α感受态细胞、通用型DNA纯化回收试剂盒、高纯度质粒小提中量试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；2×5 Super PCR Mix、pClone007载体购自北京擎科新业生物技术有限公司；组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒购自北京普利莱基因有限公司；I型胶原酶购自Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 山羊DGAT1基因克隆与生物信息学分析 使用RNA提取试剂盒提取总RNA，根据反转录试剂盒说明书获得cDNA，选择GenBank中已公布的山羊DGAT1预测基因(XM_018058728.1)作为参考序列，利用Primer Premier 5.0软件设计DGAT1基因特异性PCR引物(表1)，采用Touchdown PCR法进行扩增，25 μL的扩增体系如下：ddH2O 9.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×5 Super PCR Mix 12.5 μL。扩增程序：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，每个循环减1 ℃，15个循环；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，20个 循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用胶回收试剂盒回收目的片段，构建pClone007载体后转化DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落PCR鉴定(条件同基因克隆PCR)，送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。

获得目的基因序列后，使用NCBI中Blastn程序对不同物种的DGAT1基因序列进行比对；使用ExPASy Proteomics Server在线软件对DGAT1的氨基酸序列一级结构(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)和疏水性(http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)进行预测分析；使用Tmpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析蛋白质的跨膜区；使用EBI 在线软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius)进行信号肽预测；使用phyre2 (http//: www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2) 在线软件对山羊DGAT1蛋白质二级和三级结构进行预测分析；使用MEGA5.0软件对DGAT1基因序列构建系统进化树。

1.2.2 pcDNA3.1-DGAT1表达载体构建 克隆完成后设计亚克隆引物，上、下游引物分别加入Hind Ⅲ和BamH Ⅰ两个酶切位点(表1下划线部分)，同时上游引物加入Kozak序列(GCCACC)和Flag标签序列，由上海生工生物工程有限公司合成(表1)，以保存的DGAT1菌液为模板，以亚克隆引物扩增，胶回收后酶切纯化与pcDNA3.1载体连接，转化到感受态细胞，菌落PCR鉴定正确后扩繁提取质粒进行双酶切鉴定，最后送测序。

表1 DGAT1克隆与亚克隆引物

1.2.3 山羊原代肌内前体脂肪细胞分离、培养与传代 山羊原代肌内前体脂肪细胞分离培养采用实验室前期建立的培养方法[28]。将2日龄简州大耳羊(n=1)饥饿24 h，用新吉尔灭清洗3次，75%酒精擦拭后，颈动脉放血处死，在无菌细胞间采集背最长肌组织，PBS清洗3次，在超净工作台修剪后加入I型胶原酶消化，37 ℃消化1 h，每隔5 min轻轻振荡1次。加入等体积的10%胎牛血清培养基终止消化，经过200目筛网过滤后将滤液分装到离心管中，2 000 r · min-1离心5 min，弃上清，加入红细胞裂解液吹散沉淀，静置5 min，2 000 r · min-1离心5 min， 加入完全培养基重悬沉淀，吸取适量重悬液接种于60 mm培养皿中，即获得原代肌内前体脂肪细胞，置于37 ℃， 5% CO2培养箱内培养，当融合度达80%时开始传代，加入胰酶消化，1 000 r · min-1离心5 min，弃上清，加入适量完全培养基重悬沉淀，吸取重悬液接种于25 cm2培养瓶，每2 d换1次液。将细胞传至F3代，接种于六孔板，生长达80%时，进行转染试验。

1.2.4 pcDNA3.1-DGAT1转染细胞 参照Lipofectamine®3000试剂盒说明书进行转染。本试验以转入pcDNA3.1-DGAT1质粒作为试验组，转入pcDNA3.1质粒作为对照组。转染前弃掉完全培养液，PBS清洗3次，每孔加入900 μL Opti饥饿处理4 h。吸取50 μL Opti与3 μL lip3000配成预混液A，吸取50 μL Opti、2.5 μL P3000、1 000 ng质粒配成预混液B，将A液与B液充分混匀，静置30 min后转入细胞，放入37 ℃， 5% CO2培养箱内培养，6 h后更换终浓度为50 μmol · L-1油酸的完全培养基[29]，48 h后收集细胞。

1.2.5 油红O染色和甘油三酯含量测定 利用油红O染色法观察过表达DGAT1后山羊肌内脂肪细胞脂滴生成的变化情况。用于染色的肌内前体脂肪细胞接种于6孔板，过表达DGAT1基因2 d后弃去培养基，PBS清洗3次，10%甲醛固定30 min，吸弃甲醛，PBS清洗3次，加入1 mL油红O工作液染色20 min，弃去油红O工作液后使用PBS清洗3次，于显微镜下观察并拍照[28]，最后使用700 μL异丙醇提取油红O并检测OD510 nm值[30]。按照甘油三酯测定试剂盒(E1013，北京普利莱基因技术有限公司)的说明书进行操作，使用酶标仪测定在波长为550 nm处的吸光度。

1.2.6 细胞总RNA提取及RT-qPCR 使用TRIzol法提取收集细胞的总RNA，利用紫外分光光度计检测总RNA浓度及OD260 nm/OD280 nm，按照反转录试剂盒说明书反转录cDNA，稀释10倍，存放于-20 ℃备用。利用Primer Premier 5.0软件设计定量引物，过表达DGAT1后检测脂质代谢相关基因的表达，以UXT基因作为试验的内参基因[31]，见表2。RT-qPCR反应体系：cDNA稀释液1 μL，上、下游引物各1 μL，荧光染料(TB Green)10 μL，ddH2O 7 μL。RT-qPCR程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个待测样本设3个生物学重复和3个 技术重复。

1.2.7 数据统计与分析 实时荧光定量PCR以泛表达转录子 (ubiquitously expressed transcript,UXT)为内参基因，使用2-△△Ct法进行分析，其中△△Ct=[(Ctgene-CtUXT)]试验组-[(Ctgene-CtUXT)]对照组。本研究中所有的结果数据用“平均值±标准差(Mean±SD)”表示，显著性检验使用SPSS20.0软件中One-way ANOVA分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

表2 RT-qPCR引物信息

2 结 果

2.1 山羊DGAT1基因克隆与生物信息学分析

本试验以简州大耳羊肌内前体脂肪细胞cDNA为模板，通过RT-PCR法获得与预期目的片段大小的特异条带，回收纯化连接T载体，转化大肠杆菌，菌落PCR鉴定后送测序。结果表明，成功克隆得到DGAT1基因序列1 651 bp(GenBank登录号：MT221183)，包含5′ UTR 125 bp， CDS区1 470 bp，3′ UTR 56 bp，编码489个氨基酸残基(图1)。Blastn分析表明，山羊DGAT1基因与GenBank中绵羊(NM_001110164.1)、牛(NM_174693.2)、猪(NM_214051.1)、人(NM_012079.6)的核苷酸相似性分别为99.52%、97.35%、91.50%、88.00%，且山羊与绵羊、牛及猪的DGAT1基因CDS区均为1 470 bp， 而人的DGAT1基因CDS区长1 467 bp(表3)。

生物信息学分析发现，DGAT1蛋白分子式为C2567H3940N690O661S21，分子量为55 717.01 u。等电点PI为9.61，该蛋白体外半衰期在哺乳动物网织红细胞离体状态下为30 h，其蛋白不稳定系数为38.95。脂肪系数为99.35，总平均亲水系数为0.144。山羊DGAT1的氨基酸序列共发现10个跨膜区域，分别位于氨基酸第84～103、148～118、161～184、207～189、252～267、305～280、320～350、424～403、428～444、 476～454位，N端在膜外侧(图2A)。山羊DGAT1蛋白质疏水性预测最大值是2.867(第135位氨基酸)，最小值是-2.889(第15位氨基酸)。在5～85区有较强的亲水性，在86～122、130～145、151～205、405～448、456～476区有较强的疏水性(图2B)，综合来看，DGAT1蛋白大部分为较强的疏水区域，表现为疏水性，推测DGAT1为疏水性蛋白。信号肽预测结果显示，山羊DGAT1蛋白不存在信号肽序列。二级结构预测显示，DGAT1蛋白中α螺旋占70%，无规则卷曲占21%，无β折叠;三级结构预测显示，山羊、绵羊、人、牛、猪、小鼠的DGAT1蛋白三级结构高度相似，均以α螺旋结构为主，无β折叠(图3)。利用MEGA5.0软件对GenBank中6个不同物种DGAT1基因序列构建系统进化树，如图4显示，山羊与绵羊(NM_001110164.1)亲缘关系最近，与牛(NM_174693.2)、猪(NM_214051.1)、人(NM_012079.6)亲缘关系较远，与小鼠(NM_010046.3)、大鼠(NM_053437.1)亲缘关系最远。

表3 不同物种DGAT1基因CDS区序列比对

2.2 山羊DGAT1基因组织表达

以UXT为内参基因，利用RT-qPCR技术检测DGAT1基因在山羊不同组织中的mRNA表达谱。结果显示，山羊DGAT1基因在所检测的组织中均有表达，且在小肠中的表达量最高(P<0.01)，在脾中的表达量最低(图5)。

2.3 pcDNA3.1-DGAT1载体构建

DGAT1基因序列通过亚克隆，并纯化后和pcDNA3.1质粒同时进行Hind Ⅲ与BamH Ⅰ双酶切，T4 Ligase连接后转化到感受态细胞中，挑取阳性菌落送测序，同时扩繁提质粒进行双酶切鉴定，结果显示，在1 200 和2 000 bp之间有条带(图6)，测序结果与预期序列完全一致，证明pcDNA3.1-DGAT1载体构建成功。

2.4 DGAT1过表达对山羊肌内前体脂肪细胞脂代谢的影响

pcDNA3.1-DGAT1转染肌内前体脂肪细胞并诱导48 h后，收集细胞，利用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率，结果显示，pcDNA3.1-DGAT1组相比pcDNA3.1组的DGAT1基因表达水平上升282.3倍(图7，P<0.01)。

油红O染色结果显示，pcDNA3.1-DGAT1组较pcDNA3.1组脂滴明显增加(图8A和8B)，且pcDNA3.1-DGAT1组OD510 nm值极显著高于pcDNA3.1组(图8C，P<0.01)。甘油三酯测定结果显示，pcDNA3.1-DGAT1组甘油三酯含量极显著高于pcDNA3.1组(图8D，P<0.01)。

在山羊肌内前体脂肪细胞中过表达DGAT1基因后，通过实时荧光定量PCR检测发现，GPAM显著上调1.34倍(P<0.05)，ADRP和过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1 (ACOX1)基因分别极显著上调1.35和2.17倍(P<0.01)，而AGPAT6显著下调0.66倍(P<0.05)，丙二酰辅酶A去羧化酶(MLYCD)、HSL基因分别极显著下调0.64、0.59倍(P<0.01)，DGAT2、TIP47、LPL、ATGL的mRNA表达量无明显变化(图9)。

3 讨 论

Angiolillo等[32]通过对3个不同品种9只山羊进行转录组测序，从而得到了DGAT1基因的序列为1 552 bp，且与牛、猪、人均具有较高的序列相似性(>90%)，可见DGAT1基因在不同物种具有较高的序列保守性，然而，该报道仅仅上传了DGAT1的部分CDS序列，这严重影响了后续对DGAT1基因的验证。本研究以四川地区的简州大耳羊为试验材料，利用RT-PCR的方法克隆得到了山羊DGAT1基因CDS区全序列，通过序列比对发现，一部分序列与前人上传的序列完全一致。这弥补了山羊DGAT1基因序列不完整的缺陷，从而为后续研究DGAT1调控山羊脂质代谢的作用奠定了基础。

Cao[33]对48种生物的59种DGAT1进行DGATs多重序列比对，发现DGAT1同种型的氨基酸残基平均数量为(515±44)，其中疏水性残基超过40%。本试验从肌内前体脂肪细胞中得到的山羊DGAT1基因序列编码489个氨基酸残基，并具有较高疏水性的特征，与前人研究结果相似。Liu等[34]预测DGAT1具有8～10个疏水区域并认为是构成跨膜的结构域，这与DGAT1定位于细胞内

三酰甘油是一种储存脂质，可作为能量储存库以及信号分子和膜生物发生底物的来源[34]。DGAT1通过催化二酰基甘油和酯酰辅酶A的连接来形成甘油三酯[37-38]。过表达DGAT1可显著增加小鼠脂肪组织与骨骼肌TAG的含量[16,22]，促进骨骼肌IMF的沉积[21]，而在小鼠DGAT1活性缺失后心脏甘油三酯合成受到抑制[23]。本研究中，DGAT1基因的过表达可显著促进山羊前体脂肪细胞甘油三酯形成和脂质沉积。可见，DGAT1在不同物种中对细胞脂质的合成均具有重要的调控作用。

本试验发现，过表达DGAT1还可促进GPAM、ADRP等其他脂质合成相关基因的表达。GPAM催化三酰基甘油和磷脂合成反应的第一步，可调控甘油三酯的量[4]。ADRP被认为参与了脂滴形成、转运和分泌过程，余康[6]发现，在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达ADRP基因后甘油三酯含量提高。另一方面，过表达DGAT1也显著下调了MLYCD、HSL等脂解相关基因的表达。MCD(MLYCD)可催化丙二酰辅酶A脱羧为乙酰辅酶A，从而阻断脂肪酸的从头合成[39]。HSL则是脂肪分解的限速酶，可促进机体脂肪动员[8]。推测DGAT1可通过提高脂质的合成和抑制脂质的分解从而促进脂质沉积。然而，DGAT1促进脂质沉积的具体分子机制还需要更进一步的研究。

4 结 论

本研究克隆得到1 651 bp的山羊DGAT1基因序列，包含5′UTR 125 bp，CDS 1 470 bp，3′ UTR 56 bp，编码489个氨基酸残基；山羊DGAT1在小肠中表达量最高，而在脾中表达量最低；过表达DGAT1基因可促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质合成，并对脂质代谢相关基因的表达有显著影响。这些结果将为进一步阐明DGAT1在山羊肌内脂肪沉积过程中的作用机制提供理论基础。