山羊CREBZF蛋白两种亚型过表达载体的构建及其对子宫内膜上皮细胞凋亡的影响

牛宏宇，张瑞雪，齐茂振，马玉洁，曲 栓，靳亚平，林鹏飞

(西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100)

CREBZF蛋白是cAMP反应元件结合蛋白(CREB)/激活转录因子(ATF)蛋白家族的成员，是一种含有b-ZIP结构域的转录因子[1]。CREBZF被发现于单纯疱疹病毒(HSV)在机体中的潜伏过程，能够竞争性抑制HSV的结构蛋白VP16与宿主细胞因子(HCF)形成复合体，进而抑制HSV的复制[2]。CREBZF因与内质网应激蛋白CHOP结构类似，可以与ATF4、X-盒结合蛋白1(XBP1)和同为CREB/ATF蛋白家族成员LUMAN等相互作用，参与调控哺乳动物的未折叠蛋白反应和内质网应激过程[3-5]。由于选择不同的翻译起始位点，CREBZF基因能够翻译成为两种蛋白亚型，一种长亚型CREBZF(又被称为SMILE)，一种短亚型Zhangfei。无论长短亚型，CREBZF蛋白的一级结构均包含一个b-ZIP、一个酸性激活域和一个宿主细胞因子结合域(HBM)[6]。但与其它b-ZIP蛋白不同，由于CREBZF的HBM缺乏天冬氨酸残基，因此不能像其它b-ZIP蛋白一样通过形成同源二聚体与靶基因的启动子区结合发挥转录激活作用，而是需要与其他蛋白相互作用共同调控靶基因的转录[7]。

前期研究发现，CREBZF参与调控哺乳动物的生殖内分泌过程。CREBZF通过影响Nr4a1和Nr5a1的表达水平，促进hCG诱导小鼠间质细胞中睾酮的产生[8]。CREBZF在小鼠子宫内膜上皮高表达，与胚胎植入密切相关，并被雌激素显著上调[9]。在小鼠卵巢颗粒细胞中，CREBZF通过调节ERK1/2和mTOR信号通路促进细胞凋亡[10]。山羊是人类重要的肉乳食品来源，雌性山羊的繁殖性能直接影响生产效益[11-12]。子宫内膜容受性(RE)的建立决定了胚胎能否顺利着床，在这个过程中，子宫内膜上皮细胞的凋亡发挥了关键作用[13-14]。

近年来，关于影响反刍动物胚胎附植和子宫容受性基因的研究越来越多，然而，CREBZF在山羊子宫中的作用仍未见研究报道。由于山羊CREBZF基因CDS区碱基GC含量高，难以通过PCR直接对其全长进行克隆，限制了对山羊CREBZF的深入研究。无缝克隆技术又称“Seamless Cloning/In-Fusion Cloning”技术，是一种能够高效地将多个基因片段与载体连接的新方法，具有连接精确、操作简单、成本低等优点[15-16]。本试验通过分段扩增CREBZF基因和无缝克隆技术联用，构建了编码山羊CREBZF两种亚型的基因过表达载体，并探究其对子宫内膜上皮细胞凋亡过程的影响，为深入研究CREBZF对山羊胚胎附植和子宫内膜容受性的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

DMEM/F-12培养液和Opti-MEM无血清培养液购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自Invitrogen公司；Turbofect转染试剂购自Fementas公司；RNA提取试剂、高保真PCR酶、限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ、DNA Marker购自TaKaRa公司；反转录试剂盒购自艾科瑞生物公司；无缝克隆酶(C113-02)、荧光定量试剂(Q311-02)购自Vazyme公司；无内毒素质粒小提中量试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；抗CREBZF兔多克隆抗体(DF3447)购自Affinity公司；抗GAPDH鼠单克隆抗体(JC-PA003)购自晶彩生物公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为中晖赫彩公司产品。预染蛋白Marker购自GenStar公司。Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(KGA108)购自凯基生物公司。

1.2 细胞培养

永生化山羊子宫内膜上皮细胞系由本实验室建立、鉴定并保存[17]。将保存的gEECs复苏，使用DMEM/F-12完全培养液，置于培养箱中在5% CO2、37 ℃条件下培养，当细胞密度达到80%汇合时进行传代。本试验所用细胞均保证处于对数生长期，细胞活性大于95%。

1.3 过表达载体的构建

1.3.1 引物设计与合成 根据NCBI中CREBZF的基因序列(XM_018042803)，应用Primer Premier 5.0软件在其CDS区分段设计引物。其中，CREBZF的基因片段由2个片段同源重组构成，片段A正向引物F1的5′端添加了一段含有HindⅢ 酶切位点的上游载体同源臂，片段B反向引物R2的3′端添加了一段含有EcoRⅠ 酶切位点的下游载体同源臂，同时使2个片段之间存在一段重复序列互为同源臂。短亚型Zhangfei基因片段的正、反向引物均添加了载体同源臂。各同源重组片段引物设计技术原理见图1，引物序列见表1，斜体表示载体同源臂，下划线表示酶切位点。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 目的基因片段和线性化载体的获取 使用TRIzol提取山羊子宫内膜上皮细胞总RNA,通过反转录试剂盒得到cDNA并作为模板，使用高保真酶进行PCR扩增分别获得目的基因片段。载体构建所使用的pcDNA3.1(+)空载体由本实验室保存，使用限制性内切酶HindⅢ 和EcoRⅠ 对pcDNA3. 1(+)载体进行双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定，使用试剂盒纯化回收。

1.3.3 同源重组反应和转化感受态细胞 使用NanoDrop One仪器测定基因片段和线性化载体浓度，计算各组分使用量。SMILE重组反应体系：片段A 5.7 ng，片段B 17.22 ng，线性化pcDNA3.1

图1 引物设计技术原理Fig.1 Schematic representation of primers design

表1 目的基因片段引物序列

(+)载体108 ng，ExnaseⅡ无缝克隆酶2 μL，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，加DEPC水至20 μL总体积；Zhangfei重组反应体系：Zhangfei基因片段17.72 ng，线性化pcDNA3.1(+)载体108 ng，Exnase Ⅱ无缝克隆酶2 μL，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL, 加水至20 μL总体积。反应条件：37 ℃作用30 min，然后立即置于冰上冷却。将重组产物转化至DH5α感受态细胞(购自天根生化科技有限公司)，37 ℃摇菌60 min，涂于含有氨苄的LB固体培养基，37 ℃培养箱中倒置培养12 h。用于转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞。挑取单菌落于含有氨苄的LB液体培养基中，37 ℃摇菌12 h，抽提重组质粒，并进行双酶切鉴定和测序，鉴定正确的重组质粒分别命名为pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1(+)-Zhangfei。

1.4 载体转染gEECs

将gEECs培养于6孔板，设置空白对照组、空载体组、过表达SMILE组和过表达Zhangfei组，待细胞长至80%汇合时换为无血清培养液，其中空白对照组不进行转染操作，空载体组、过表达SMILE组和过表达Zhangfei组分别转染pCDNA3.1(+)空载体、pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1(+)-Zhangfei。先将2 μg质粒和4 μL转染试剂加入100 μL Opti-MEM中预混，室温避光孵育20 min， 然后滴加在细胞培养皿中，使质粒终浓度为1 μg·mL-1，轻微晃动使其均匀分布。转染12 h后更换为完全培养液，24 h后收集细胞。

1.5 qRT-PCR检测CREBZF基因mRNA的表达

使用TRIzol提取各试验组gEECs的总RNA，利用反转录试剂盒得到cDNA。根据NCBI查阅的山羊CREBZF(XM_018042803)和GAPDH(XM_005680968.3)基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计qRT-PCR引物。CREBZF上游引物：TACCTTCGGGCCGTCTTAG；下游引物：CGAG-TCGTCCTGGTCTTCC。GAPDH上游引物：TC-TGCTGATGCCCCCATGTT；下游引物：TGACCTTGCCCACAGCCTTG。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以反转录得到的cDNA为模板，使用ChamQ SYBR荧光定量试剂在Bio-Rad CFX96 PCR仪中进行qRT-PCR。

1.6 Western blot检测SMILE和Zhangfei蛋白的表达

收集各试验组细胞，使用裂解液提取细胞总蛋白质，BCA法测定蛋白浓度，剩余蛋白样品加入5×Loading Buffer混匀，煮沸15 min。样品进行SDS-PAGE电泳，120 V电压湿转90 min，将膜转移至含10%脱脂奶粉的封闭液中，室温封闭120 min，去除封闭液，用TBST(含0.05% Tween20)洗膜3次，每次10 min，在1∶1 000稀释的CREBZF一抗中4 ℃ 孵育过夜，用TBST洗去一抗，在1∶5 000稀释的羊抗兔二抗中室温孵育60 min，TBST洗去二抗，加入显色试剂，在成像系统中观察结果。

1.7 流式细胞术检测凋亡率

将构建的过表达载体转染gEECs，方法同“1.4”。除空载组、过表达组之外，设置细胞凋亡阳性对照组，在收集细胞之前向阳性对照孔中加入5% DMSO处理30 min、人工诱导细胞凋亡[18]。采用胰酶(不含EDTA)消化收集细胞，PBS洗涤2次， 使用500 μL的Binding buffer重悬细胞，根据说明书要求依次加入Annexin V-FITC和PI，混匀，室温避光反应15 min，使用BD公司高速分选型流式细胞仪进行检测。

1.8 数据统计分析

2 结 果

2.1 山羊SMILE基因分段片段和Zhangfei基因片段的PCR扩增

PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，图2可见大小约为285、861和886 bp的特异性条带，符合预期条带大小。

M.DNA Marker DL2000；1.SMILE片段A加载体上游同源臂；2.SMILE片段B加载体下游同源臂；3.Zhangfei片段加载体上、下游同源臂M.DNA Marker DL2000; 1.Fragment A of SMILE gene with a sequence homologous to the vector’s positive strand; 2.Fragment B of SMILE gene with a sequence homologous to the vector’s nagetive strand; 3.Zhangfei gene flanked by two sequences homologous to the vector图2 各目的基因片段PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification result of gene fragments

2.2 重组载体的双酶切鉴定与测序

利用限制性内切酶Hind Ⅲ 和EcoRⅠ 对两种重组质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，结果(图3)显示pcDNA3.1(+)-SMILE泳道出现大小约为5 380 bp的线性化载体条带和1 089 bp的SMILE条带，pcDNA3.1(+)-Zhangfei泳道出现大小约为5 380 bp的线性化质粒条带和846 bp的Zhangfei条带。测序结果(图4)与NCBI数据库中山羊CREBZF基因CDS区同源性为100%，显示2种重组过表达载体构建正确。

M.DNA Marker DL10000；1.过表达载体pcDNA3.1(+)-SMILE双酶切产物；2.过表达载体pcDNA3.1(+)-Zhangfei双酶切产物M.DNA Marker DL10000;1.Double enzyme digestion pro-ducts of pcDNA3.1(+)-SMILE;2. Double enzyme digestion products of pcDNA3.1(+)-Zhangfei图3 2种重组过表达载体双酶切鉴定结果Fig.3 Double enzyme digestion identification of the two recombinant overexpression vectors

2.3 转染过表达载体对相关基因表达的影响

如图5所示，空载体组与对照组相比，CREBZF基因的mRNA表达水平无显著性差异；转染pcDNA3.1(+)-SMILE组和pcDNA3.1(+)-Zhangfei组与空载组比较，CREBZF基因mRNA的表达水平均显著上升(P<0.01)。

Western blot结果显示(图6)，各组在50和40 ku均显示条带，过表达组相关蛋白表达量显著高于空白对照组和空载组。结果表明：在生理条件下，gEECs主要表达长亚型SMILE，外源转入pcDNA3.1(+)-SMILE后长、短两种亚型的表达量均显著增加，外源转入pcDNA3.1(+)-Zhangfei后只有短亚型Zhangfei表达量显著增加。

2.4 流式细胞术分析转染过表达载体细胞凋亡率

如图7所示，pcDNA3.1(+)组gEECs凋亡率为8.45%，与空载体组相比，转染pcDNA3.1(+)-SMILE组凋亡率显著上升至12.41%(P<0.01)，转染pcDNA3.1(+)-Zhangfei组凋亡率上升至9.83%，但统计学差异不显著，阳性对照组凋亡率则显著上升至14.00%(P<0.01)，表明过表达长亚型SMILE促进gEECs凋亡。

3 讨 论

为了深入研究CREBZF的功能和机制，本团队在前期成功构建了小鼠CREBZF的慢病毒过表达载体和shRNA慢病毒干扰载体，并转染至NIH 3T3细胞系进行了验证[19]。而本研究的难点在于，山羊CREBZF基因的CDS区全长碱基GC含量高达70%，而3′端末尾35 bp碱基GC含量不足30%，并且具有一段“TTAAAATTTTCTTTTTT”序列，这种特殊性给引物设计带来了困难，不易通过普通PCR对该基因CDS区全长直接克隆。赵炜等[20]通过分段克隆结合重叠延伸PCR方法，成功构建了高GC含量的人KAP-1基因定点突变载体。但重叠延伸PCR需要对基因片段进行多次PCR扩增，且传统的载体构建过程需要进行酶切和连接过夜等一系列操作，耗时相对较长。无缝克隆技术是以同源重组原理为基础的新技术，能够通过同源臂的方式将目的基因片段之间及片段与载体连接，具有步骤简单、效率高、无冗余序列等优点，近年来被广泛用于生物技术和转基因动物育种等领域[21-25]。因此，本研究通过分段克隆的方式，解决了该基因由于高GC含量而难以直接克隆目的基因全长的问题。同时结合无缝克隆方法，在设计引物时使CREBZF基因2个片段之间形成同源臂，再添加上下游载体同源臂，借助无缝克隆酶快速、高效地构建了该基因的两种重组过表达载体，为深入探究CREBZF蛋白不同亚型的功能差异和作用机制提供试验材料。

前期研究发现，CREBZF在小鼠整个发情周期的子宫中都有表达，主要翻译为长亚型SMILE，短亚型Zhangfei的表达很微弱[9]，这与本研究在山羊子宫内膜上皮细胞中的结果(图6对照组)相一致，表明CREBZF在不同物种的同类组织器官中，长短亚型的选择性翻译存在一定的保守性。值得注意的是，本研究发现gEECs表达的长亚型SMILE在50～60 ku处显示为2条条带，在外源转入pcDNA3.1(+)-SMILE后，这2条带均同时被过表达(图6)，Xie等[6]在MCF-7细胞中发现了同样的现象，推测这与蛋白翻译后的修饰有关，因为在翻译后被修饰可以改变蛋白自身在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率[26]。而SMILE在gEECs中具体存在哪种翻译后修饰，还有待于深入研究。

图7 流式细胞术检测凋亡率Fig.7 Apoptotic rate detected by flow cytometry

胚胎能否在子宫顺利着床取决于两个方面：一是胚胎发育到具有着床能力的阶段，另一个重要的条件是子宫需要处于容受性状态(RE)[27]。在胚胎附植之前，子宫内膜在卵巢类固醇激素的作用下发生形态结构和功能的转变，使子宫进入RE，但RE的存在时间并不长久，如果胚胎无法在这一窗口期完成附植，则造成妊娠失败[28]。子宫内膜上皮细胞作为子宫内膜重要的组成部分，其凋亡的发生在子宫RE转变过程中发挥重要的调控作用，但具体调控网络仍需完善[29]。越来越多的研究发现，CREBZF基因与细胞凋亡过程有着密切的联系。比如，在ONS-76人脑髓母细胞瘤细胞中添加凋亡诱导剂白藜芦醇，Zhangfei的表达水平显著升高，而过表达Zhangfei能够通过上调TrkA和Egr1，进而诱导ONS-76细胞凋亡[30]；在犬骨肉瘤细胞系中，Zhangfei可以协同肿瘤抑制蛋白p53，从而抑制细胞生长和促进凋亡发生，并激活骨钙素的产生，诱导触发细胞的程序性死亡[31]。本课题组前期研究发现，SMILE通过磷酸化细胞内调节激酶1/2 (ERK1/2)和p70 S6激酶(S6K1)抑制ERK1/2和mTOR信号通路，使BAX和剪切型Caspase-3的表达水平上升，促进小鼠卵巢颗粒细胞发生凋亡[10]。本研究的结果显示，SMILE在山羊子宫内膜上皮细胞中发挥与上述研究相似的促凋亡作用，提示SMILE可能参与调控子宫内膜转向或离开RE状态，最终影响山羊胚胎的附植，但是否通过BAX和Caspase等途径进行调控需要进一步探究。

4 结 论

成功构建了山羊CREBZF蛋白两种不同亚型的过表达载体：pcDNA3.1(+)-SMILE和pcDNA3.1(+)-Zhangfei；过表达长亚型SMILE能够促进gEECs发生凋亡。