蒙古斑点马黑、白毛色区域皮肤中相关基因的表达研究

白东义，拉希玛，赵若阳，陶娜拉，韩海格，丁文淇，贾紫洁，刘慧莹，王文兴，黄博光，芒 来*

(1. 内蒙古农业大学动物科学学院 内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室 农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站 内蒙古农业大学马属动物研究中心，呼和浩特 010018； 2. 内蒙古中蕴马产业集团，锡林浩特 026000； 3.锡林郭勒盟镶黄旗农牧和科技局，镶黄旗 013250)

内蒙古自治区地域辽阔，草原面积广，被世人誉为马的故乡，具有深厚的马文化历史渊源和文化底蕴。目前有蒙古马、阿巴嘎黑马、锡尼河马、鄂伦春马、三河马、锡林郭勒和科尔沁马等品种。其中蒙古马有乌珠穆沁马、乌审马、百岔铁蹄马和巴尔虎马等优良类群[1-2]。蒙古马起源于西伯利亚东部草原，是世界上最古老的马品种之一。蒙古马经过漫长的自然和人工选择，形成了抗病力强、易增膘、掉膘慢、耐寒冷、耐粗饲、合群性好等特征。其体质粗糙结实、体躯粗壮、体格较小、胸廓宽深、鬐甲明显、肌肉丰满、四肢较短而质坚实有力、被毛浓密、毛色复杂，常见的毛色有栗、骝、黑、青等，还有较特殊的海骝、鼠灰、兔褐、沙毛、花毛、斑点毛等。其中，斑点毛色的表型丰富多样，有均匀分布在全身的斑点，也有位于背部的毯状斑点，而且斑点的大小、形状各不相同[3-4]。本研究以蒙古斑点马为试验对象，基于以往对马属动物毛色的研究基础，将毛色表型与转录组表达谱进行了关联分析，填补了蒙古马毛色研究领域的新内容。对多个与毛色相关的候选基因进行分子生物学、转录组学和组织学鉴定，为今后蒙古斑点马选育环节中对毛色的选择提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样本 从内蒙古自治区包头市达茂旗购置3匹具有典型斑点表型的雌性成年蒙古马(图1)，分别采集蒙古斑点马躯体部位黑、白斑点区域皮肤组织样品，通过观察发现，在黑毛色皮肤区域和白毛色皮肤区域有一个渐变色的过程，因此，在采样时采集黑色区域的中心区，即图1中的绿色方框位置。在采集样本时首先注射地拖嘧啶和布托啡诺对马匹进行麻醉，然后用手术刀割取黑、白色目标区域各1 cm ×1 cm皮肤，然后对马匹皮肤取样处进行冲洗、消毒和缝合。将采集获得的样本首先分割成2块， 1块 立即投入液氮存储后转移至实验室-80 ℃冰箱储存。另1块用 4% 的多聚甲醛固定24 h，然后乙醇梯度脱水至 100%无水乙醇溶液中，在4 ℃冰箱保存。

图1 蒙古斑点马斑点表型Fig.1 Spot phenotype of Mongolia spotted horse

1.1.2 试验仪器与设备 轮式切片机、捞片机、烤片机(Leica，德国)，通风橱、超纯水系统(PALL，美国)，精密天枰、荧光倒置显微镜(ZEISS，德国)、显微成像系统(IX73，奥林巴斯，日本)，真空泵、微波炉、移液器、多功能台式冷冻离心机(Eppendorf，德国)，多功能酶标仪(BIO-TEK，美国)，多用电泳仪(BIO-TEK)，全能型成像系统(Bio-Rad，美国)，移动紫外灯、CFX96 Touch荧光定量PCR仪(Bio-Rad)、C1000 Touch梯度PCR仪(Bio-Rad)、凝胶成像仪(Bio-Rad)、高压灭菌锅(TOMY)、台式高速冷冻离心机(EPPENDORF)、切片盒、湿盒、暗盒、染色缸、甘油、一次性吸管、透明指甲油、摇床、数据中心服务器等。

1.1.3 主要试剂与耗材 TRIzol(Invitrogen，美国)、Rnase-free ddH2O(天根，北京)、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems，美国)、SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ (TaKaRa，日本)、氯仿(国药)、核酸染料(北京天根，中国)、异丙醇(国药)、无水乙醇(国药)、96孔板光学贴膜(ABI)、PCR 用96孔板(axygen)、多聚甲醛(sigma，美国)、高效切片石蜡(56～58 ℃，58～60 ℃， Leica，德国)、苏木素(GHS116-500ML，Sigma，美国)、伊红(HT110116-500ML，Sigma，美国)、碳酸锂(V900124-500G， Sigma，美国)、浓盐酸(中国)、二甲苯(天津科茂，中国)、无水乙醇(天津科茂，中国)、95%乙醇(利尔康，中国)、75%乙醇(山东安捷高科，中国)、丙三醇(天津北宏，中国)、显微镜盖玻片(世泰，中国)、黏附载玻片(世泰，中国)、显微镜载玻片(美韦德，中国)、一次性切片刀片(Leica，德国)、组织包埋盒(世泰，中国)、PBS缓冲液、羊血清、DAPI，一抗：Anti-TYR antibody(Abcam)、Anti-TYRP1 antibody(Abcam)、 Anti-DCT antibody(Abcam)、Anti-CD34 antibody(Abcam)、Anti-MiTF antibody(Abcam)、Anti-hair cortex Cytokeratin/K40 antibody [AE13] (Abcam)；二抗： goat anti rabbit IgG(Jackson,美国)、goat anti mouse IgG(Jackson,美国)等。

1.1.4 主要使用的软件与网站 MobaXterm_Personal_10.9、Cutadapt1.10、FastQC 0.10.1、Tophat & HISAT 2.0、StringTie 1.3、RStudio、R x64 3.5.3、DESeq2、Cuffmege、Cuffdiff、Cufflinks、FileZilla、TBtools、Notepad++、NCBI(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)、GO(Gene Ontology，http://www.geneontology.org)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)

1.2 试验方法

1.2.1 石蜡切片及HE染色 为观察蒙古斑点马黑毛色区域和白毛色区域皮肤的表型信息，对黑、白毛色区域皮肤进行了石蜡包埋和组织切片制作，具体步骤如下：将梯度脱水后的皮肤组织使用二甲苯和石蜡进行透明、过渡、包埋，蜡块经过修整和冷却后，使用切片机纵切皮肤毛囊组织得到厚度7 μm的切片，经捞片和烘片得到黑毛色区域和白毛色区域皮肤组织切片。使用二甲苯对切片脱蜡，经过梯度水化后，使用苏木素和伊红进行染色，最后经过脱水和二甲苯清洗，使用中性树胶封片，晾干后在显微镜下观察HE染色结果。

1.2.2 RNA-seq文库构建及测序 从各样品中取3 μg提取总RNA用于构建cDNA文库。建库及后续测序工作在安诺优达基因科技(北京)有限公司完成。首先，对总RNA 进行质量检测，并将RNA片段化(平均片段长度约为350 nt)；其次，进行逆转录合成cDNA，末端修复，加碱基A及测序接头，经琼脂糖凝胶电泳分离并回收大小为 450～500 bp 左右的目的片段;其后，进行PCR扩增并纯化，质检筛选片段大小为450～500 bp左右的文库，从而完成整个文库制备工作;最后，将构建好的文库使用 Iumina NextSeq500进行测序

1.2.3 转录组表达谱数据分析 利用比对软件，将获得的原始测序序列比对到马参考基因组序列上，并且进行转录组数据分析，分析流程如下:1)测序数据质量检测及分布：从Illumina 高通量测序平台得到的原始图像数据文件经 CASAVA 软件进行碱基识别后转化为原始测序序列(raw reads)，以FASTQ文件格式存储。随后对碱基测序错误率和碱基含量进行了检测和评估。2)测序数据过滤：对原始数据进行以下几个方面的过滤，最终得到高质量的clean reads:去除接头污染的 reads→去除低质量的 reads→去除含 N 比例大于 5%的reads→去除与核糖体 RNA 匹配的reads。3)基因组比对分析：采取HiSAT2软件将过滤后的RNA-seq数据同马参考基因组(EquCab3.0)进行比对分析。随后根据序列的比对信息，分别统计比对到外显子、内含子和基因间区的序列数，绘制出唯一比对序列在参考基因组基因各区域的分布。4)转录本组装：转录本拼接采用StringTie拼接软件完成。StringTie是利用 RNA-Seq 比对结果快速组装转录本并预计表达水平的软件。StringTie先将 reads分为不同的类，然后再针对每个类的 reads生成一个拼接图确定转录本，之后每个转录本产生一个流型神经网络的最大流算法来评估表达水平，将复杂的数据集组装成转录本。5)表达量差异表达分析统计及聚类分析：mRNA的表达量利用Countreads进行归一化处理；利用DEseq2进行差异表达分析，并选取P<0.01和log2| fold change | >1作为有效差异表达的筛选条件，得出上、下调基因个数。6)差异表达 mRNAs 功能富集分析：以得到的差异表达mRNAs作为背景，分别进行GO注释和KEGG富集分析。

1.2.4 RT-qPCR验证转录组mRNA数据 根据转录组数据结果筛选了3个(TYR、TYRP1、DCT)与毛囊发育及色素合成相关的差异表达基因，通过NCBI中GenBank检索马的TYR、TYRP1和DCT基因序列，利用NCBI在线引物设计功能设计特异性引物(表1)并选择GAPDH基因为内参基因，后将设计好的引物送Invitrogen公司合成。对皮肤组织提取的总RNA 按照HiScript®III 1 st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书进行反转录。荧光定量PCR是采用SYBR®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，Bulk。cDNA中添加引物和荧光酶根据说明书反应体系进行实时荧光定量PCR试验。

表1 引物列表

1.2.5 蒙古斑点马TYR、TYRP1和DCT基因蛋白定位 对皮肤组织切片进行免疫组织化学染色，试验流程依据UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒说明书制定。切片经过脱蜡水化处理，PBS(pH 7.2～7.4)冲洗后滴加正常非免疫动物血清，室温孵育30 min；PBS冲洗后滴加第一抗体分别为：Anti-TYR antibody(Abcam)、Anti-TYRP1 antibody(Abcam)、 Anti-DCT antibody(Abcam)，4 ℃湿盒孵育24 h；PBS冲洗后滴加荧光二抗goat anti rabbit IgG(Jackson,美国)、goat anti mouse IgG(Jackson，美国)，暗盒孵育2 h；PBS冲洗加DAPI后将片子放置于暗盒孵育10 min；PBS冲洗后用甘油封片。

2 结 果

2.1 蒙古斑点马体躯黑、白皮肤区域表型采集

蒙古斑点马皮肤组织石蜡切片经过HE染色结果显示，蒙古斑点马皮肤毛囊结构完整，可以清晰地观察到毛囊的毛乳头、毛母质、毛干、内根鞘和外根鞘等。其中，黑色被毛对应的皮肤组织表皮处有明显的黑色素沉积。毛囊的毛乳头、毛母质部位同样有黑色素沉积(图2A)。而白色被毛对应的皮肤组织表皮处、毛囊的毛乳头和毛母质部位均无黑色素沉积(图2B)。此外，通过统计发现，蒙古斑点马黑色被毛皮肤组织和白色被毛皮肤组织的毛囊长度、毛囊密度以及毛乳头宽度均无显著差异(图3)。

绿色箭头所指部位是毛球部The green arrow points to the position of hair bulb图2 蒙古斑点马毛囊形态及色素分布Fig.2 The hair follicle morphology and pigment distribution in Mongolian spotted horses

图3 黑色被毛皮肤组织和白色被毛皮肤组织的毛囊表型比较Fig.3 Comparison of hair follicle phenotype between black and white skin tissues of Mongolian spotted horse

2.2 蒙古斑点马体躯黑、白区域皮肤转录组比较

蒙古斑点马6个RNA 测序文库总共获得约512 M(million)原始读段(raw reads)。其中，6个RNA测序文库各获得82 027 190、91 580 266、93 635 418、 74 062 856、78 684 708、92 543 100条原始下机reads，除去低质量的reads 和接头污染以及其他污染，最终获得约500 M(million)有效数据(valid data)，分别为80 057 270、89 617 730、91 562 830、 72 442 634、76 848 028、90 466 312 条高质量的reads。从测序数据质量结果来看，总Q20的比例均99.99%，总Q30的比例在98.02%～98.69%之间，总GC含量在43～44%之间(表1)。可以说明本研究中的测序数据碱基读取的准确率较高。

表2 蒙古斑点马RNA-seq数据质控

利用DEseq2软件对蒙古斑点马黑色和白色皮肤组织文库中的所有 mRNA进行显著性差异分析(图4)，利用DESeq2软件对两个部位之间对比进行差异表达分析。使用Benjamini-Hochberg法校正P值小于0.05，log2|fold change| 值大于 1作为有效差异表达的阈值。共鉴定出740个基因的表达量在黑、白两个不同颜色皮肤组织中存在显著差异(P<0.05)，其中109个基因在蒙古斑点马黑色皮肤组织表达量较高，215个基因在蒙古斑点马白色皮肤组织表达量较高。

图4 差异基因统计图Fig.4 Scatter plot of differentially expressed genes

利用R语言的GOseq包进行差异表达基因GO富集分析，选取P<0.05的GO条目。使用KOBAS软件(http://www.genome.jp/kegg/)来实现差异表达基因在KEGG通路中的富集统计。通过将差异表达基因同GO 数据库进行比对，找出显著富集的GO Term。本研究对蒙古斑点马黑色皮肤组织间差异表达的109个基因进行了GO注释。结果发现，差异表达的109个基因被注释到26条 显著GO通路上，其中注释到生物过程中的13条 通路 上，在细胞组成被注释到7条通路上，在分子功能被注释到6条通路上。差异表达基因及GO通路富集到的GO term分别为melanosome(黑素体)，melanosome membrane(黑素体膜)，integral component of membrane(膜的组成部分)，structural constituent of muscle(肌肉的结构成分)，actin binding(肌动蛋白结合)，protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity(蛋白质酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性)，motor activity(运动活动)，melanosome organization(黑素体组织)，cellular response to lipopolysaccharide(细胞对脂多糖的反应)，melanin biosynthetic process(黑色素生物合成过程)，developmental pigmentation(发育性色素沉着)，response to interferon-gamma(对γ干扰素的反应)，muscle contraction(肌肉收缩)，sarcomere organization(肌节组织)，cardiac muscle tissue morphogenesis(心肌组织形态发生)，myofibril assembly(肌原纤维组装)，skeletal muscle contraction(骨骼肌收缩)，protein ubiquitination(蛋白质泛素化)，striated muscle contraction(横纹肌收缩)，skeletal muscle fiber development(骨骼肌纤维发育)，calcium ion binding(钙离子结合)，oxidoreductase activity(氧化还原酶活性)，structural constituent of muscle(肌肉的结构成分)，actin binding(肌动蛋白结合)，protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity(蛋白质酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性)。

为了进一步了解差异表达基因，本研究对蒙古斑点马差异表达基因进行了KEGG分析。结果显示，蒙古斑点马显著富集的通路有11个(P<0.05)，这些通路分别为Tyrosine metabolism(酪氨酸代谢)，Hematopoietic cell lineage(造血细胞谱系)，Toll-like receptor signaling pathway(Toll样受体信号通路)，Melanogenesis(黑色素生成)，TNF signaling pathway(TNF信号通路)，Calcium signaling pathway(钙信号通路)，Insulin secretion(胰岛素分泌)，Adrenergic signaling in cardiomyocytes(心肌细胞中的肾上腺素信号传导)，Glycolysis / Gluconeogenesis(糖酵解/糖异生)，Oxytocin signaling pathway(催产素信号通路)，cGMP-PKG signaling pathway(cGMP-PKG信号通路)。

对通过差异表达分析筛选到的蒙古斑点马黑、白区域皮肤组织中的差异基因做出韦恩图，结果发现蒙古斑点马109个基因在黑色皮肤组织中表达，215个 基因在白色皮肤中表达(图5)。

图5 蒙古斑点马黑、白皮肤组织mRNA差异表达韦恩图Fig.5 Venn diagram of differential expressed mRNAs in black and white skin tissues of Mongolian spotted horse

2.3 实时荧光定量PCR验证

为了验证转录组测序数据的有效性，本研究测定了对黑白色皮肤组织中的差异表达基因TYR、TYRP1和DCT的表达量，统计结果显示PCR表达趋势与测序表达趋势一致(图6)，说明测序结果可用于后续生物信息学分析。

图6 黑、白皮肤组织中TYR、TYRP1和DCT基因qRT-PCR结果Fig.6 The qRT-PCR results of TYR，TYRP1 and DCT in black and white skin tissues

2.4 蒙古斑点马TYR、TYRP1和DCT基因蛋白定位

为了进一步验证数据的准确性，本研究对文献中总结的和本试验中筛选到的与黑色素形成相关的基因进行免疫荧光验证试验。结果显示(图7、图8)，TYR和TYRP1蛋白在毛囊的毛球部位没有信号，而DCT蛋白在毛囊毛球的毛母质位置有信号(图9)。

图A含黑色素毛囊，图B不含色素毛囊，图中黄色箭头所指的位置是毛囊的毛球位置。下同Picture A contains black pigmented hair follicles and picture B does not contain pigmented hair follicles, the position indicated by the yellow arrow in the picture is the position of the hair bulb of the hair follicle. Same as below图7 斑点马背部毛囊TYR蛋白免疫荧光结果图Fig.7 The results of TYR immunofluorescence in hair follicles at back of spotted horse

图8 斑点马背部毛囊TYRP1蛋白免疫荧光结果图Fig.8 The results of TYRP1 immunofluorescence in hair follicles at back of spotted horse

3 讨 论

哺乳动物色素沉着是一个复杂的调控过程，受不同因素的控制。黑色素决定了皮肤颜色，黑色素生成受亚细胞水平调控。黑色素生成过程中，各种黑素生成相关酶和抑制剂的合成和表达起关键作用[3]。酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)被认为是催化黑素细胞中黑色素合成的关键酶[4]。TYR催化两个主要的反应：酪氨酸羟基化生成3，4-L -二羟基苯丙氨酸(3，4-L-dihydroxyphenylalanine，dopa)，和dopa氧化生成多巴醌(dopaquinone)[5]。之后，多巴醌自发转化为多巴铬。酪氨酸酶相关蛋白2/ 多巴异构酶(tyrosinase- related protein 2 / dopachrome tautomerase，TRP2/DCT)催化dopachrome转化为5，6-二羟基吲哚-2-羧酸(dopachrome to 5，6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)。TRP1催化DHICA氧化酶氧化生成 5，6-吲哚醌羧酸(indole-5，6-quinone-2-carboxylic acid)。TRP1和DCT密切相关，可以产生不稳定的醌类化合物，并进行进一步聚合，最终导致黑色素生成[6]。酪氨酸酶及其相关蛋白是TYR基因家族中不同基因的产物，其5′端有转录因子的共同识别位点[7]。编码TRPs家族的基因通常被称为TYPS，TYR、TRP1与DCT基因相类似。目前认为，tyrp1基因编码氧化酶活性，而tyrp2基因编码多巴色互变酶[8]。人类TYR是由tyr基因编码的。TYPS、TYR和TRP1受上游的小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)调控，影响基因表达；它们具有多态性，可以行使不同功能，这使得几种色素沉着状态会同时存在，以及突变的存在[9]。同时，有研究表明，酪氨酸和酪氨酸酶相关蛋白I (TRP-I)在黑素细胞中不表达。此外，缺乏TRP-2的表达会影响蛋白银位点的产物[9]。这也许是蒙古斑点马黑色斑点部位毛囊有色素沉积的原因。

图9 斑点马背部毛囊DCT蛋白免疫荧光结果图Fig.9 The results of DCT immunofluorescence in hair follicles at back of spotted horse

大多数哺乳动物有两种或两种以上的毛色，这是由皮肤表面的两种色素决定的。黑色素是在黑素小体发育过程中由各种蛋白质产生的。黑素体是黑素细胞中的细胞器，可以合成和运输黑色素[10]。调控黑色素生成的一组重要的相关基因是酪氨酸酶基因家族(TYR，酪氨酸酶相关蛋白1，TYRP1， dopachrome tautomeraseDCT)。TYR是调控黑色素生成的关键酶。TYR、TYRP1和DCT在黑素小体发育的III期发挥作用，而黑色素小体蛋白基因PMEL是控制毛色的主要候选基因之一[11]。多巴醌是一种高活性的中间体，通过一系列复杂的氧化还原反应循环最终形成黑色素[12]。当TYR活性高时，合成真黑素。相反，褐黑素是在其活性不高时合成的[13]。TYR中的错义突变His214Asn可能引起鸡的巧克力毛色和黑素体结构的改变[14]。兔子中TYR基因的3个未翻译区域的缺失导致黑色素合成减少[15]。与白水貂相比，TYRP1基因表达水平会在黑色毛皮中上调[16]。TYR基因在青灰色和黑色鸡的表达水平高于白色[17]，但在浅棕色和白色组之间没有显著差异。然而，DCT基因的表达仅在青灰色组上调，与水貂和家兔的研究一致[18]。说明TYR、TYRP1和DCT基因富集在细胞成分，黑素体膜中；TYR和TYRP1基因富集于黑色素生物合成过程、黑素小体组织和色素沉着DCT基因在TYR的发育色素沉着和黑色素生物合成过程中富集。

动物的被毛颜色是毛囊中的黑色素细胞决定的，被毛附着在皮肤的最外层，具有防御、保护和信息交流作用[19-20]。本研究发现，蒙古斑点马毛囊结构与其他哺乳动物毛囊结构基本一致，主要由毛干、毛根两部分构成。粱朝录[21]等在对双峰驼毛囊群结构的研究中提出，双峰驼的毛囊群结构与肉食兽的毛囊群相似，属于复合毛囊。同样，Trautmann[22]研究发现，骆驼、狗和猫的毛囊都属于复合毛囊。赵若阳[23]对阿尔山雪兔毛色的研究发现，雪兔毛囊结构为典型的复合毛囊，同一个毛道中同时可以长出多根毛囊。而在蒙古斑点马毛囊上未发现此现象。这与李超[24]对蒙古马被毛毛囊形态的研究结果描述相符。因此，可以说明蒙古斑点马为非复合毛囊。

转录组技术可以从细胞或者组织中获取所表达的全部转录本，这些转录本可以表现出机体各种细胞类型、生理状态、组织类型或生命阶段下所表达的全部基因。因此，通过转录组技术可以反映出特定时期或生命状态下全部基因的表达水平及调控规律。转录组技术在动物毛色研究上也有很多的应用价值。许钟峯[25]对同一头陆川猪黑色和白色皮肤组织进行了转录组测序，得知黑色皮肤相对于白色皮肤有7个基因表达显著上调，包括TYRP1、DCT、TRPM1等与黑色素合成相关基因，由于白色皮肤因缺少TYRP1和TYRP2基因的表达造成代谢通路中无法合成真黑色素。赵博昊等[26]利用高通量测序技术筛选獭兔毛色相关基因，共筛选出17 327个差异表达基因，其中上调基因8 445个，下调基因8 882个，在这些差异基因当中，包含与毛色形成的相关基因，例如TYR、TYRP1、ASIP等基因，这些毛色相关基因都与酪氨酸及黑色素形成有着密切联系。Yao等[27]利用Illumina HiSeq X Ten测序技术检测了绵羊白色、浅棕色、黑色和青灰色毛色的相关基因，转录组分析结果发现，DCT、TYR、TYRP1、PMEL、SLC45A2、MLANA等 6个差异表达基因参与了毛色的调节。这些基因与黑素细胞分化、黑素小体运输、发育性色素沉着和黑色素生物合成过程有关。Xiong等[28]使用Illumina NovaSeq测序平台对波尔和麻城山羊毛囊的黑色和白色区域的皮肤进行了转录组测序，在黑色和白色区域的皮肤中共鉴定出165个差异表达基因，认为TYR、DCT、TYRP1、GPR143、SLC45A2等可能与杂交山羊黑色素沉着有关，Agouti可能在颜色模式的形成中起着关键的发育调控作用。Li等[29]使用转录组技术对白色和黑色蒙古马进行了表达谱分析，鉴定出了231 个调控蒙古马毛色的差异表达基因，其中 119 个为下调基因、112 个为上调基因。Fan等[17]以苏尼特绵羊皮肤样本为研究对象，通过 Illumina HiSeqTM2000 测序平台开展了皮肤组织 RNA-seq 研究，发现在已知45 个毛色基因中，13 个在黑色被毛绵羊皮肤中显著高表达，包括TYRP1、TYR、MLPH、MATP和Silver基因等。而本研究中通过差异表达分析筛选到了109个基因在黑色皮肤组织中表达。包括TYR、TYRP1、DCT基因，预示蒙古斑点马斑点表型的形成与这3个基因具有直接的联系。

4 结 论

本试验以蒙古斑点马为研究对象，分别对蒙古斑点马体躯白色区域和黑色区域皮肤的表型和差异表达基因进行分析并验证。经HE染色发现白色区域和黑色区域皮肤毛囊组织表型上并没有显著差异，但其中的黑色素分布有明显的差异，黑色素细胞主要分布于黑色皮肤组织表皮和毛囊毛球部位，而白色皮肤组织相对应的位置未发现有黑色素沉积。其次对白色和黑色区域皮肤进行转录组测序，测序结果中得到了324个基因的表达量在黑、白两个不同区域皮肤组织中存在显著差异，其中109个基因在蒙古斑点马黑色皮肤组织表达量较高，215个基因在蒙古斑点马白色皮肤组织表达量较高。差异表达的mRNAs主要富集到了黑色素生成通路(主要参与基因包括TYR、TYRP1、DCT、PAX3、DAPL1等)。通过免疫组化试验发现，TYR和TYRP1蛋白在毛囊的毛球部位不表达，DCT在毛囊毛球的毛母质部位表达。从而得知，蒙古斑点马的毛色形成主要由黑色素形成相关基因的表达量所决定，与其他表型相近的哺乳动物未有太大的差距。