内标法测定养正消积胶囊中黄芪甲苷含量

2022-03-08王一波李晓鹏张永锋李文烈柏艳柳

食品与药品 2022年1期

王一波，张灿，李晓鹏，张永锋,4，李文烈,4，柏艳柳,4*

（1.石家庄以岭药业股份有限公司，河北石家庄 050035；2.河北省中药炮制技术创新中心，河北石家庄 050035）；3.络病研究与创新中药国家重点实验室，河北石家庄 050035； 4.石家庄市复方中药技术创新中心，河北石家庄 050035；

养正消积胶囊是石家庄以岭药业股份有限公司研制的复方中药，主要用于健脾益肾、化瘀解毒。适用于不宜手术的脾肾两虚、淤毒内阻型原发性肝癌辅助治疗等[1]。处方由黄芪、女贞子、人参等十六味药组成。现行标准收载于《中国药典》2020年版一部，标准中含量测定项目为女贞子中的齐墩果酸和熊果酸[1]。方中药味黄芪中的黄芪皂苷类有效成分有镇痛、抗肿瘤等作用[2-4]，以黄芪甲苷为代表成分。为了更好地控制养正消积胶囊中黄芪甲苷含量，本研究参考中国药典[1]及相关文献[5-7]，采用高效液相-蒸发光散射（HPLC-ELSD）法对其进行含量测定，但ELSD的影响因素较多，且本方中黄芪甲苷含量限度较低，因此稳定性会受到影响。采用内标法[8-9]，可避免因样品前处理及进样体积误差对测定结果的影响，因此本文采用内标法，建立HPLC-ELSD测定养正消积胶囊中黄芪甲苷含量的方法，有利于控制该药品质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 高效液相色谱仪（美国Waters公司，Waters 2695 Separations Module，Waters 2998 Photodiode Array Detector， Waters 2424 ELS Detector）；AT-201电子分析天平（Mettler Toledo公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水系统；KQ250B型超声波清洗仪（250 W，40 kHz）。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品（批号：110781-201717）、木兰脂素对照品（批号：110882-201708）均来源于中国食品药品检定研究院；养正消积胶囊6批次（石家庄以岭药业股份有限公司生产）；甲醇（色谱纯，Fisher），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～18 min，33 % A；18～30 min，33 %→65 % A；30～32 min，65 % A；32～37 min，65 %→90 % A；37～38 min，90 %→33 % A；38～48 min，33 % A）；流速：1.0 ml/min；蒸发光散射检测器（漂移管温度70 ℃，气体压力25 psi）；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 内标储备液制备取木兰脂素对照品适量，制成每1 ml含木兰脂素0.30 mg的甲醇溶液，作为内标储备液。

2.2.2 黄芪甲苷储备液制备取黄芪甲苷对照品适量，制成每1 ml含黄芪甲苷0.20 mg的甲醇溶液，作为黄芪甲苷储备液。

2.2.3 对照品溶液制备精密量取上述内标储备液和黄芪甲苷储备液适量，分别制成每1 ml含木兰脂素60 μg、黄芪甲苷40 μg的70 %甲醇的低浓度对照品溶液和每1 ml含木兰脂素60 μg、黄芪甲苷120 μg的70 %甲醇的高浓度对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品内容物，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25 ml，水浴蒸干，残渣加水25 ml溶解并转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次25 ml，合并正丁醇液，先用1 % NaOH溶液洗涤3次，每次20ml，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次25 ml，合并正丁醇液，正丁醇液中精密加入内标储备液1 ml，蒸干，残渣加70 %甲醇使溶解并转移至5 ml量瓶，摇匀，滤过，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

按养正消积胶囊处方比例及工艺制备不含黄芪的阴性样品，按2.3项下供试品溶液制备方法进行处理，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，依法进行检测，见图1。结果表明，供试品溶液色谱图中，在与黄芪甲苷和木兰脂素色谱峰相应位置上，有相同保留时间的色谱峰；而阴性样品溶液在此保留时间处无干扰，即该方法专属性良好。

图1 高效液相色谱图

2.5.2 线性关系考察取黄芪甲苷及木兰脂素对照品适量，精密称定，分别制得含黄芪甲苷浓度为25.13，41.88，62.82，83.76，125.64 μg/ml及含木兰脂素浓度为60.78 μg/ml的5个不同浓度的对照品混合溶液。精密吸取20 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以（ln黄芪甲苷峰面积/ln木兰脂素峰面积）为纵坐标，以（ln黄芪甲苷浓度/ln木兰脂素浓度）为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：y=0.4934x-0.4474，r=0.9999。结果表明：黄芪甲苷与木兰脂素浓度的对数比在0.7849～1.1768范围内呈良好线性关系。

2.5.3 精密度试验精密吸取黄芪甲苷和木兰脂素混合对照品溶液及同一份供试品溶液，各进样5次，测定黄芪甲苷峰面积和木兰脂素峰面积，计算其二者的峰面积的对数比。结果：对照品峰面积对数比的RSD值为0.15 %，供试品中峰面积对数比的RSD值为0.18 %，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验精密吸取黄芪甲苷和木兰脂素混合对照品溶液及同一份供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，24 h进样测定。均以黄芪甲苷峰面积和木兰脂素峰面积的对数比的RSD进行分析。结果：在24 h内，对照品峰面积对数比和供试品峰面积对数比的RSD值分别为0.64 %和0.58 %，表明对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.5 重复性试验取同一批样品，分别取高、中、低3个样品量，每个样品量3份，按2.3项下供试品溶液的制备方法，分别进行提取，制备，照上述色谱条件测定，计算黄芪甲苷含量。结果黄芪甲苷平均含量为0.2052 mg/g，RSD值为2.88 %，表明方法重复性良好。

2.5.6 回收率试验取已知含量的同一批样品约1 g，共9份，精密称定，分为3组，分别精密加入高、中、低浓度的黄芪甲苷对照品甲醇溶液50 ml，按2.3”项下供试品溶液的制备方法，分别进行提取，制备，照上述色谱条件测定，计算回收率，黄芪甲苷的平均回收率为98.99 %，RSD为2.78 %。结果表明，方法的准确度良好。具体结果见表1。

2.5.7 样品测定用所制定的含量测定方法，对6批样品进行含量测定，结果6批样品中黄芪甲苷含量分别为0.0806，0.0734，0.0938，0.0645，0.0949，0.0638 mg/粒。

3 讨论与结论

3.1 检测器及内标法的选择

由于黄芪甲苷为末端吸收，且响应值较低，因此采用紫外检测器干扰较大。ELSD是一种通用的质量型检测器，能检测到半挥发性或不挥发性的化合物。ELSD的影响因素较多，因此稳定性会受到影响，且本方中黄芪甲苷含量限度较低，曾采用HPLC-ELSD法对方中黄芪甲苷进行含量测定，针对同一供试品，在同一天内不同间隔时间内进行多次测定，含量测定结果差异很大。而采用本文中的内标法进行测定后，重复性结果RSD能达到2.88 %。考虑到以上因素，采用内标法检测方中的黄芪甲苷含量。

3.2 内标物及流动相选择

对于内标物的选择，一般原则是：内标物应与待测物分子结构相近，在色谱图中内标物在待测物附近出峰；样品中不存在内标物，且内标物与待测物分离完全；内标物应是纯物质；内标物与样品互溶，且不发生化学反应[10]。本文考察了甘草酸铵、白花前胡乙素、木兰脂素等一系列化学性质稳定的化合物，在乙腈-水（33:67）的色谱条件下，只有木兰脂素的保留时间与黄芪甲苷最接近，但两者保留时间相差仍较大，为了避免仪器的不稳定性所造成的灵敏度差异，后采用梯度洗脱的方法，使木兰脂素和黄芪甲苷保留时间适中，并且与杂质峰得到较好的分离，因此选择木兰脂素为内标，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱。